[发明专利]一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用

说明书

一．技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡   四种成分的试剂盒及应用。应用两步法半巢式-多重PCR技术，设计用于深加工食品中鸡、牛、羊、猪同时检测的试剂盒，将其灵敏度相比现有的PCR和荧光定量PCR技术提高1-3个数量级，可用于DNA严重降解的深加工食品中肉类种属的检测。

 

二．背景技术

肉制品的掺杂掺假是我国食品质量控制面临的重要挑战之一。近年来，不法企业在利益的驱使下，使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉等价格相对较高的肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。近期，河南等地又出现了使用鸡肉、鸭肉等冒充羊肉串的事件。肉类食品掺假已成为我国食品质量安全的又一“潜规则”。

以聚合酶链反应（PCR）为基础的技术已成为食品中肉类种属鉴定的核心方法。根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来，实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。如今，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，且进入了国内权威的检测技术标准（SN/T 2051-2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法、GB/T 21101-2007 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PCR方法），市场上也出现了相关的商品化试剂盒（Takara Real Time PCR Porcine DNA Detection Kit），在对肉制品掺假进行控制与监管中发挥了重要作用。本实验室也研发了对四种肉类进行同时快速鉴别的应用多重PCR方法（专利申请号：201210099651.1），可对食品中猪牛羊鸡成分进行高通量的同时快速鉴别。

然而，在我们（国家农副产品质检中心）对肉类样品种属的实际检测中，无论使用上述标准中的PCR或荧光定量PCR方法，还是使用商品化的PCR试剂盒，对一些经过深加工的肉制品中提取的DNA进行检测时，常常无法得到扩增条带或荧光信号。这些深加工肉制品主要包括肉松、火腿肠及红肠、熟制面制品中的肉馅等。据统计，在我们近期检测的108份深加工食品中，使用已有方法未能鉴别的有27份，占25.0%。我们推测，这些食品中的肉类DNA经过深加工已经严重降解并片段化，导致作为检测模板的完整目标DNA片段极少，加之有可能存在一定的PCR反应抑制剂，现有的PCR或荧光定量PCR方法的灵敏度已经不能满足检测的需要。为了解决这一问题，我们尝试了优化反应条件、使用两步法半巢式-多重PCR技术、截短引物等多种策略，经过试验，使用半巢式-多重PCR在确保特异性的前提下显著提升了检测灵敏度，在此基础上，我们开发了同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的高灵敏度试剂盒，可有效地对深加工食品进行种属鉴别。

 

三．发明内容

本发明需要解决的问题是：针对目前对DNA严重降解的深加工食品中肉类种属鉴定缺乏有效方法的现状，应用两步法半巢式-多重PCR技术，开发一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的高灵敏度试剂盒，优化并确定试剂盒的使用方法，可对应用现有标准方法和试剂盒方法无法检测的深加工肉类食品进行种属鉴别。

本发明的总体技术路线是：以深加工食品中提取的总DNA为模板，首先使用一对通用引物进行第一轮扩增，扩增目标为猪、牛、羊（包括山羊和绵羊）、鸡4个物种线粒体基因组上490bp的同源片段；然后将第一轮扩增产物作为第二轮扩增的模板，正向引物仍使用第一轮扩增的正向引物，反向引物使用猪、牛、羊、鸡4个物种的特异性引物，进行第二轮多重PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带分子量不同对肉类种属进行鉴别。基于上述两步法半巢式-多重PCR技术，对实验流程中的关键反应条件、试剂成分及浓度进行优化，将半巢式-多重PCR中两轮PCR反应所需试剂分别配制为预混液1和预混液2，开发出同时鉴别食品中猪、牛、羊、鸡四种成分的高灵敏度试剂盒。使用者只需将深加工食品中提取的总DNA与预混液1混合后进行第一轮PCR反应，继而将第一轮PCR产物与预混液2混合后进行第二轮PCR反应，大大简化了操作步骤，降低了对操作者的专业要求，3-4小时即可对深加工食品中的4种肉类种属进行准确鉴别。