[发明专利]一种杂交链霉菌胰蛋白酶酶原及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种链霉菌胰蛋白酶酶原，特别是一种杂交胰蛋白酶酶原及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

链霉菌胰蛋白酶(SGT)（E.C.3.4.21.4）是一种来源于灰色链霉菌的碱性丝氨酸蛋白酶，其在氨基酸编码基因结构上属于pre-pro-protease类型，而通过对灰色链霉菌的基因组测序发现编码SGT的基因SprT中，除去SGT自身信号肽和链霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端还具有一段前导肽(-Ala-Pro-Asn-Pro-)(图1)；通过前人对链霉菌胰蛋白酶在灰色链霉菌中的分泌，纯化，氨基酸测序以及相关生理生化功能的研究，发现在链霉菌气生菌丝和营养菌丝分化时，链霉菌胞外开始出现活性胰蛋白酶，纯化和氨基酸测序也仅能获得活性的胰蛋白酶的信息，而带有前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化机理却未有见到报道。而与其结构及性质较为相似的牛胰蛋白酶的产生是通过胰脏产生肠激酶活化胰蛋白酶酶原来产生活性胰蛋白酶，具体的激活机理：肠激酶特异性识别并切割胰蛋白酶前导肽，而哺乳动物胰蛋白酶酶原前导肽氨基酸序列正好是肠激酶酶切特异性识别序列（-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-）(图1.)。因此，鉴于链霉菌中带有野生前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原激活的具体机理未有相关报道，并且根据链霉菌活性胰蛋白酶和活性牛胰蛋白酶具有相似的氨基酸组成和蛋白质结构，拟通过构建基因工程菌，建立获得在N端具有牛胰蛋白酶酶原前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，对于杂交链霉菌胰蛋白酶酶原晶体结构的研究，以及其激活机理的研究具有至关重要的意义，并且为生产活性链霉菌胰蛋白酶提供了一种方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产杂交胰蛋白酶酶原（hybridized tryspinogen）的基因工程菌，其特征在于染色体上携带有杂交胰蛋白酶酶原（hybridized tryspinogen）基因（smt）。

所述杂交胰蛋白酶酶原（hybridized tryspinogen）的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种杂交胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图1：

第一步胰蛋白酶酶原基因的获得及分析

首先，化学全合成灰色链霉菌（Streptomyces griseus）胰蛋白酶其次，毕赤酵母（Pichia pastoris）的表达系统有着特殊的密码子偏好性，如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母（Pichia pastoris）可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过类胰蛋白酶基因在毕赤酵母中进行表达的密码子适用指数（CAI）分析，发现在类胰蛋白酶基因中并无毕赤酵母无法识别及利用的稀有密码子，其次，在类胰蛋白酶基因上游加入EcoR I限制性内切酶位点以及来源于牛胰蛋白酶酶原的前导肽编码序列，在其下游部分加入Not I限制性内切酶位点，进行体外扩增类胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列为：SEQ ID NO:1；

第二步杂交胰蛋白酶酶原重组质粒的构建

为了使smt基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用smt基因序列5′端的EcoRⅠ限制性内切酶位点与3′端的NotⅠ限制性内切酶位点，将smt基因克隆入载体pPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于pPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。

将含有smt基因的载体与要连接的表达载体pPIC9K进行EcoR I和Not I酶切，连接得到含有SprT基因的重组质粒pPIC9K-smt。

第三步类胰蛋白酶基因工程菌的构建

将重组质粒pPIC9K-smt电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达类胰蛋白酶的组成型毕赤酵母重组菌株。