[发明专利]一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因番茄的制备方法。

背景技术

心血管疾病与骨质疏松症正威胁着人类的生命健康，尤其给老年人的生活带来严重影响。目前治疗两种疾病的有效药物分别是降钙素基因相关肽(hαCGRP)和鲑鱼降钙素(sCT)。

降钙素(Calcitonin，CT)具有调节钙-磷代谢、抑制骨基质分解、促进成骨的功能。现在广泛应用的是鲑鱼降钙素(sCT)，其活性比人降钙素活性高40倍。

降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)是迄今所知的人体最强的舒血管物质。CGRP在扩张正常、病变冠状动脉的同时，还可增加侧支循环，改善血液供应。

但目前临床用hαCGRP与sCT主要是通过组织提取或化学合成的方法获得，存在来源有限和价格昂贵等问题。

发明内容

本发明是要解决目前降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素的来源有限且价格昂贵的问题，提供一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法。

本发明表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行：

一、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70％的乙醇溶液消毒1min，再采用消毒液消毒18min；

二、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗净，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26～28℃下光照培养11～13d，光照强度为2100lx，光照时间为18h/d，得番茄幼苗；

三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部0.5×0.5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d；

四、用接菌环挑取一环降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，接种于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培养基中，于28℃、220rpm振荡培养，至菌液OD₆₀₀为0.4，将菌液于4℃、4500rpm离心收集菌体，然后重悬于50mL YEB培养基中，作为转化用的侵染液；

五、将步骤三预培养后的外植体投入步骤四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植体吸干表面侵染液，转入共培养培养基上，于25～27℃暗培养；

六、将暗培养后的外植体转至脱菌培养基中，于25～27℃培养5d，光照强度为2000lx，光照时间为18h/d，然后将外植体转至筛选培养基上，于25～27℃培养，光照强度为2000lx，光周期为16h光照8h黑暗，每10d更换一次筛选培养基，培养至外植体上长出2～3cm的抗性芽，将抗性芽切下转接到生根培养基上培养16～20d，炼苗，植入装有沙壤土的花盆中，获得再生苗，对再生苗进行鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄；其中步骤一中消毒液为10％NaClO+2％SDS的水溶液。

本发明利用转基因植物表达sCT和hαCGRP融合基因。此种方法安全、生产成本低、易于操作，为利用转基因植物大规模生产治疗性蛋白奠定基础。

结果在1083个外植体得到的131株转基因抗性植株中，有78株显示出与质粒所扩增的目的片段大小一致的条带，阳性率59.54％，转化率7.20％。

附图说明

图1为具体实施方式九中测序峰图；图2为具体实施方式九中测序峰图；图3为具体实施方式九中测序峰图；图4为具体实施方式九中测序结果与目的基因序列比对结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行：

一、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70％的乙醇溶液消毒1min，再采用消毒液消毒18min；

二、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗净，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26～28℃下光照培养11～13d，光照强度为2100lx，光照时间为18h/d，得番茄幼苗；

三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部0.5×0.5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d；