[发明专利]一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法

权利要求书

1.一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行：

一、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70％的乙醇溶液消毒1min，再采用消毒液消毒18min；

二、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗净，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26～28℃下光照培养11～13d，光照强度为2100lx，光照时间为18h/d，得番茄幼苗；

三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部0.5×0.5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d；

四、用接菌环挑取一环降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，接种于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培养基中，于28℃、220rpm振荡培养，至菌液OD₆₀₀为0.4，将菌液于4℃、4500rpm离心收集菌体，然后重悬于50mL YEB培养基中，作为转化用的侵染液；

五、将步骤三预培养后的外植体投入步骤四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植体吸干表面侵染液，转入共培养培养基上，于25～27℃暗培养；

六、将暗培养后的外植体转至脱菌培养基中，于25～27℃培养5d，光照强度为2000lx，光照时间为18h/d，然后将外植体转至筛选培养基上，于25～27℃培养，光照强度为2000lx，光周期为16h光照8h黑暗，每10d更换一次筛选培养基，培养至外植体上长出2～3cm的抗性芽，将抗性芽切下转接到生根培养基上培养16～20d，炼苗，植入装有沙壤土的花盆中，获得再生苗，对再生苗进行鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄；其中步骤一中消毒液为10％NaClO+2％SDS的水溶液。

2.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤三中预培养培养基为含有0.5mg/L ZT和0.5mg/L IAA的MS培养基。

3.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤三中预培养的条件为：在26～28℃下光照培养，光照强度为2100lx，光照时间为18h/d。

4.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤五中共培养培养基为含有0.5mg/L ZT和0.5mg/L IAA的MS培养基。

5.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中脱菌培养基为含有0.5mg/L ZT、0.5mg/L IAA和500mg/L Cef的MS培养基。

6.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中筛选培养基为含有0.5mg/L ZT、0.5mg/L IAA、500mg/L Cef和50mg/L Km的MS培养基。

7.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中生根培养基为含有0.1mg/L IAA、250mg/L Cef和25mg/LKm的MS培养基。

8.根据权利要求1所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中在生根培养基上培养的条件为：在26～28℃下光照培养，光照强度为2100lx，光照时间为18h/d。