[发明专利]肝素钠的共振光散射检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分析技术领域，涉及一种药物分析方法。

背景技术

心脑血管疾病是人类的头号疾病杀手。随着人们生活水平提高带来的营养过剩、全球环境恶化、生活节奏加快、人口老龄化加剧，全球心脑血管疾病的发病率和死亡率正逐年增高。肝素钠是目前世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要用于心脑血管疾病和血液透析治疗，且在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素钠除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂、抗中膜平滑肌细胞增生、促进纤维蛋白溶解等作用。而以肝素钠为原料进一步加工制成的低分子肝素钠则具有更为广泛的临床医学用途，已成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症（心绞痛、心肌梗塞）等疾病的首选药物。近年来国际市场对肝素钠原料药的需求十分强劲，肝素钠制剂用量稳中有升，低分子肝素钠的市场迅速扩容并保持高速增长趋势。

肝素钠的分子结构复杂，短期内无法人工化学合成，目前只有自猪或牛肠粘膜中提取的肝素钠能够用于临床治疗。由于肝素钠目前多采用注射给药的方式用于临床，从而要求肝素钠原料药必须具备很高的纯度，方可保证制剂的用药安全。此外，肝素钠临床上用药剂量过大时可引起自发性出血，如粘膜出血、关节积血、伤口出血等。因此，精确测定肝素钠的含量具有非常重要的意义。

目前肝素钠的测定方法有生物学方法和化学方法两大类。现行药典收载的测定方法为肝素生物测定法，系通过比较肝素标准品与供试品延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用，来测定供试品的效价。化学方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法、荧光法、光散射法、电化学分析法等。例如，刘绍璞等以碱性二苯基萘基甲烷染料和碱性三苯甲烷染料为探针，采用分光光度法或光散射法对肝素钠进行测定；孙伟等以中性红为光度试剂，在pH3.0的B-R缓冲溶液中，利用中性红与肝素钠相互结合导致溶液褪色的现象，采用分光光度法测定肝素钠；郭小群等以甲基红染料作增色剂，在近中性的B-R缓冲溶液中，利用肝素钠与甲基红染料形成离子缔合物后共振瑞利散射强度显著增强的现象，采用共振瑞利散射法测定肝素钠。虽然目前已有许多文献报道了多种肝素钠的测定方法，但出于进一步提高检测准确度、灵敏度和精确度，简化操作，丰富检测方法以满足不同条件下的检测需求等目的，仍有必要继续开发更多、更先进的肝素钠测定方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肝素钠的共振光散射（RLS）检测方法，设备简单、试剂易得、易于操作、检测时间短、线性范围较宽、灵敏度较高，以丰富肝素钠的检测方法，满足不同条件下的检测需求。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

肝素钠的共振光散射检测方法，包括以下步骤：

a．标准曲线的制作

a1．在反应容器中加入Co(II)的水溶液和钴试剂的无水乙醇溶液，混匀，再加入NaOH的水溶液，混匀，再加入肝素钠的水溶液，用水稀释制成含有2.0×10^-5 mol/L Co(II)、4.0×10^-5 mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和肝素钠浓度在0.05~1.60 μg/mL范围内呈梯度的系列标准溶液；

a2．按照步骤a1所述方法配制不加入肝素钠的空白对照溶液；

a3．取步骤a1配制的系列标准溶液，用荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描，获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度，记为I；另取步骤a2配制的空白对照溶液，同法测定550nm处的散射强度，记为I₀；按照公式△I₅₅₀= I- I₀计算△I₅₅₀，制作△I₅₅₀对肝素钠浓度的标准曲线；

b．样品测定

b1．在反应容器中加入Co(II)的水溶液和钴试剂的无水乙醇溶液，混匀，再加入NaOH的水溶液，混匀，再加入未知肝素钠含量的样品的水溶液，用水稀释制成含有2.0×10^-5 mol/L Co(II)、4.0×10^-5 mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和未知肝素钠浓度的待测溶液；

b2．按照步骤b1所述方法配制不加入肝素钠的空白对照溶液；