[发明专利]人G-CSF的制备方法

说明书

本申请是2007年3月5日提交的申请号为200780008077.1(PCT/IN2007/000105)之申请“人G-CSF的制备方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种改进的高产量生产G-CSF的方法，其通过在生产期期间高盐诱导增加质粒稳定性来实现。

背景技术

细胞因子粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony  Stimulating Factor，G-CSF)治疗显著改善了患有严重的慢性中性白细胞减少患者的生活质量[Jones等JAMA 270：1132-1133(1993)]。G-CSF是从骨髓储备释放粒细胞以及增强其抗微生物活性的强效的内源触发剂。G-CSF在急性疾病的多种临床前模型中被广泛评估，并且一般都得到了很有希望的结果[Marshall J.C.Shock 24：120-9(2005)]。由于其在化疗周期中得到证实的功效，G-CSF成为肿瘤学中重要的生物技术药物。G-CSF已被克隆并在多种类型的细胞中表达，例如微生物细胞[Souza L.M.Science 232：61-65(1986)；Hu Z.Y等Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi(1999)，20：55-57]、酵母细胞[Lasnik M.A.等Biotechnol. Bioeng.81：768-774(2003)；Lee S.M.等韩国专利KR 160934B119981116]、水稻细胞[Hong等Protein Expr Purif.在线发表(2005)]、猫细胞[Yamamoto等Gene 274：263-269(2001)]、中国仓鼠卵巢细胞[Monaco L.等Gene.180：145-150(1996)]、昆虫细胞[Shinkai等Protein Expr.Purif.10：379-385(1997)]，甚至在转基因山羊中表达[Ko J.H.等Transgenic Res.9：215-22(2000)]。用于药物用途的G-CSF主要在大肠杆菌(Escherichia coli)中以包涵体的形式生产[Jevsevar S.等Biotechnol.Prog.21：632-639(2005)]，所述包涵体是非天然构象的重组蛋白形成的不溶聚集物[Baneyx F.&Mujacic M.Nature Biotechnol.22：1399-1408(2004)]，其通常不具有生物活性[Bernardez C.E.Curr.Opin.Biotechnol.9：157-163(1998)]。G-CSF的分泌生产技术也已报道[Jeong KJ.& Lee S.Y. Protein Expr Purif.23：311-318(2001)；Lee S.Y.等Methods Mol.Biol.308：31-42(2005)]。分泌表达通常导致正确折叠形式的G-CSF释放到周质空间或细胞外培养基中，但是产量比通过包涵体形式获得的要少得多。因此，在大肠杆菌中以包涵体形式表达G-CSF具有商业优势。可以以商业上可行的方式，在分离和溶解包涵体后采用变性和复性方法容易地从包涵体获得正确折叠的、具有生物活性的G-CSF蛋白[Rudolph R，在Protein Engineering：Principles and Practice中；Cleland，J.L.，Craik，S.C.，电子数据系统；Wiley-Liss，Inc.：New York，1996；283-298页；Rathore A.S.等J Pharm Biomed Anal.32：1199-1211(2003)]。

在大肠杆菌中生产重组蛋白最有效的方法之一是补料-分批发酵，其可以以循环和非循环的模式进行。非循环方法较不复杂，因此更适于工业生产。事实上，现有技术记载了利用非循环的补料-分批方法生产GCSF的最高产量之一为4.2-4.4g/L[Yim SC等Bioprocess and Biosystems Engineering(2001，24，249-254]。为获得更高的累积量而以循环模式进行补料-分批发酵造成质粒的高不稳定性[Choi S.-J.等J.Microbiol.Biotechnol.10：321-326(2000)]，从而限制了该方法的稳健性(robustness)。