[发明专利]结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种科研用方法，特别涉及一种用于研究光合作用的方法。

背景技术

植物的生长发育离不开光合作用，光合作用是生物界所有物质代谢和能量代谢的物质基础，它包括一系列光物理、光化学和生物化学转变的复杂过程。对光合作用的研究有助于人们更为深入地了解光合作用的过程，进而有目的地对植株，特别是农作物进行转基因处理，以提高光合作用的效率。

目前，研究参与光合作用的基因功能，主要通过稳定转化获得过表达、干涉植株，或是通过突变体，周期长，工作量大。这种研究方法效率低，很难高效地筛选出与光合作用有关的基因。

原生质体是植物细胞除去细胞壁后，由细胞质膜包裹着的那部分具有生物活性的物质。随着多种原生质体分离酶，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶、崩溃酶等的发现，在实验室条件下大量制备高活性的原生质体已发展成为一种常规技术。已经分离得到许多植物材料的原生质体。Yoo等报道了一种利用纤维素酶R-10以及离析酶R-10分离原生质体的方法(Yoo, S.D., Cho, Y.H., and Sheen, J. (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565-1572.)。现阶段，通过优化酶解拟南芥材料的酶液体系，摸索酶解时间，改良原生质体制备过程中的关键步骤，比如：离心，过滤等可以方便而又快速地获得大量具有很强光合活性的原生质体(Riazunnisa, K., Padmavathi, L., Scheibe, R., and Raghavendra, A.S. (2007). Preparation of Arabidopsis mesophyll protoplasts with high rates of photosynthesis. Physiol Plantarum 129, 679-686)。

原生质体瞬时表达技术是以原生质体为转化受体，通过一定的方法将外源基因导入原生质体内，使外源基因得以快速表达，并且能在短期内维持表达水平的技术。

原生质体瞬时表达技术与传统的稳定转化技术相比，主要的不同之处在于稳定转化将外源基因转化进入植物体内，并整合到植物基因组中，因此基因信息可遗传；而在原生质体瞬时表达系统中，则是将外源基因构建到载体质粒上，转化后在原生质体中瞬时表达，不整合到植物基因组中，也不产生可遗传后代。现阶段，尽管传统的稳定转化已经不存在技术问题 ，但是稳定转化周期长，需要繁琐的工作来鉴定转基因植物，工作量大，外源基因表达不稳定且效率低，因而满足不了目的基因的高通量功能分析的需求。此外，部分基因的突变体植株或者过表达植株会突变致死，这使得这类基因的研究工作受到限制。以原生质体为转化受体的基因瞬时表达技术的产生，有利于缓解这种需求，已成为目前分子生物学研究中的重要技术手段(Sheen， 2001)。

有关原生质体瞬时表达技术的最早报道是1969年，Aoki和Takebe利用烟草叶肉细胞原生质体和烟草花叶病毒第一次成功地将外源核酸引入原生质体(Aoki and Takebe， 1969)。此后，出现了多种DNA瞬时转化方法，比如，聚乙二醇（PEG）转化法、电激转化法、基因枪转化法等，使得DNA瞬时转化效率得到很大的提高，在此基础上，可以制备多种植物材料的原生质体，转化目的基因，研究基因定位、基因功能和信号通路(Yoo et al.， 2007; Zhang et al.， 2011)。而随着一些新的、经济敏感的报告基因如：β-葡萄糖醛酸酶（GUS）、荧光素酶（LUC）以及绿色荧光蛋白（GFP）被引入原生质体瞬时表达系统，可以根据报告基因活性来反映外源基因的表达水平，原生质体瞬时表达系统也因此得到更为广泛的使用(Sheen， 2001)。

拟南芥叶肉细胞原生质体广泛应用于基因瞬时表达研究(Yoo et al.， 2007)，信号通路研究(Sheen， 2001)，离子通道研究(Lemtiri-Chlieh and Berkowitz， 2004; Qi et al.， 2004)以及分子生物学等方面的研究(An et al.， 2003; Baek et al.， 2004; Lemtiri-Chlieh and Berkowitz， 2004; Kim et al.， 2006)。