[发明专利]一种蜡状芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蜡状芽孢杆菌及其应用。

背景技术

石油污染土壤的微生物修复技术，近十几年来在国外得到了较大发展，但是石油烃类污染物降解速度缓慢，致使治理过程延续时间较长，一直是这项技术的一个突出难点，因此寻找高效石油降解菌是当前石油污染土壤微生物修复技术的研究热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种可用于降解石油污染物的蜡状芽孢杆菌。该菌株是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种蜡状芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCCNo.6074，保藏日为2012年5月3日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1、该菌株具有如下的性质：

形态特征：菌落呈白色光滑，湿润圆菌，直径1mm～2mm；细胞为杆状，细胞直径1.0μm～1.5μm。

生理生化特征：革兰氏阳性细菌。

2、该菌株的筛选方法为：

步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO₃0.15%，(NH₄)SO₄0.15%，K₂HPO₄0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO₄·7H₂O 0.001%，CaCl₂ 0.0002%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；

步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO₃ 0.15%，(NH₄)SO₄0.15%，K₂HPO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO₄·7H₂O 0.001%，CaCl₂ 0.0002%，琼脂2%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；

步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株。

3、该菌株的鉴定方法为：

步骤一、提取总DNA：