[发明专利]一种高活性复合纤维素酶及其制备和在木质纤维酶解糖化中的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌高产纤维素酶制备的复合酶及其制备方法，以及它在木质纤维酶解糖化中的应用。

背景技术

由于能缓解能源紧张、减少环境污染、促进农村发展、避免“与人争粮，与农争地”等重要作用，利用自然界丰富的木质纤维素植物资源生产燃料乙醇已越来越受到社会的关注和支持，纤维素燃料乙醇已经成了可再生能源的重要组成部分。从木质纤维素到乙醇的生物转化过程通常包括：①木质纤维素原料预处理；②纤维素酶的生产；③纤维素的水解糖化；④纤维素水解产物（己糖）的发酵和⑤半纤维素水解产物（戊糖）的发酵。

纤维素乙醇生产过程中，纤维素酶的成本占了很大的比例，甚至达到了整个成本的一半以上。纤维素酶是利用产纤维素酶的菌株经过发酵提取精制而成的液体状复合酶制剂，包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三种酶系。目前，里氏木霉是公认的一种优秀的产纤维素酶的菌种，但其产生的纤维素酶中的β-葡萄糖苷酶活性较低，致使纤维二糖积累，影响了酶解糖化效率，进而降低了乙醇的得率。进行高活性纤维素酶制取及酶系优化在木质纤维酶解糖化中的应用对木质纤维燃料乙醇生产具有重要的实践价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是客服现有技术的不足，提供一种由爪哇正青霉高产的β-葡萄糖苷酶制备的高活性复合纤维素酶及其制备方法，并进行复合酶系优化实现其在酶解糖化木质纤维中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种高活性复合纤维素酶：所述的复合纤维素酶是由爪哇正青霉ZN-205 CCTCC NO:M208204生产的β-葡萄糖苷酶与里氏木霉Rut C-30 ATCC 56765生产的纤维素酶（里氏木霉Rut C-30 ATCC 56765生产纤维素酶的方法见参考文献1）经浓缩处理，将浓缩后的酶液进行混合得到的，得到的复合纤维素酶的β-葡萄糖苷酶活/PFA酶活最优比值为1.4；

所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC NO:M208204生产β-葡萄糖苷酶的过程如下：

挑取一环爪哇正青霉ZN-205 CCTCC NO:M208204孢子接种于种子培养基的摇瓶中，摇床上培养作为接种物；按摇瓶装液量体积的5%，将上述接种物接种于装有100ml产酶培养基的250ml摇瓶中，28℃，175rpm条件下培养5天；离心，上清液即为β-葡萄糖苷酶；

所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC NO:M208204产酶培养基：初始pH为6.0；微晶纤维素质量浓度为2.5%，蛋白胨质量浓度0.75%，KH₂PO₄ 2g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液50ml/L；吐温-80的添加质量百分比为0.05%，加水配制成1L；

其中，Mandels微量元素浓缩液：FeSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄·H₂O 1.6g/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4g/L，CoCl₂·6H₂O 3.7g/l，加水配制成1L；

1mol/l柠檬酸缓冲液：柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O 210g)，H₂O 750ml，加NaOH 78g，冷却后测pH为4.2，加水至1000ml，pH为4.45。

所述的爪哇正青霉ZN-205 CCTCC NO:M208204种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓缩液100ml/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1M柠檬酸缓冲液50ml/L，加水配制成1L；