[发明专利]特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途

说明书

发明领域

本发明属于生物学、食品与卫生检测技术领域，具体涉及特异识别沙门氏菌（血清型O8，以下简称沙门氏菌O8）的寡核苷酸适配子的用途。

背景技术

目前，国内外在食品中沙门氏菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象各有不同而各具优缺点。传统检测沙门氏菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应（PCR）技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚合酶链式反应（PCR）技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应（PCR）技术，如多重PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。

通过指数富集配体的系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子（aptamer）。其原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在 20-100 个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点。在临床检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。

利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子在生物医药和食品卫生研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。

发明内容

为了解决现有沙门氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本发明提供一种特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的应用。

特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下：5'-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3'，特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA。本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子，用于快速、准确检测沙门氏菌O8。

本发明以食源性沙门氏菌O8为目的靶分子，同时以大肠杆菌O86:K61和猪霍乱沙门氏菌为反筛菌，获得了一条沙门氏菌O8特异的适配子。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。

附图说明

图1为单链寡核苷酸（ssDNA）富集库与沙门氏菌O8结合率的测定结果图。

图2 A为寡核苷酸适配子10号与沙门氏菌O8灵敏度测定结果图。

图2 B为寡核苷酸适配子9号与沙门氏菌O8灵敏度测定结果图。

图3A为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与大肠杆菌结合比较图。

图3B为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与猪霍乱沙门氏菌结合比较图。

图3C为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与沙门氏菌O8结合比较图。

图3D 为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与双蒸水结合洗脱后空白对照图。

具体实施方式