[发明专利]一种快速的基因表达载体构建连接方法

说明书

技术领域

    本发明涉及生物基因克隆表达技术，具体是一种快速的基因表达载体构建连接方法。

背景技术

目前，较常用的基因表达载体构建方法的步骤为：（1）酶切基因：酶切体系Ⅰ：含有目的基因的T克隆载体经限制性内切酶消化，酶切体系Ⅱ：转基因载体经限制性内切酶消化；以含有双酶切EcoRⅠ与xhoⅠ位点的T克隆载体及植物转基因载体为例，

酶切体系Ⅰ如下：

注：37℃充分酶切2-3小时；

酶切体系Ⅱ如下：

  注：37℃充分酶切2-3小时；

（2）回收获得目的基因片段及酶切载体：凝胶电泳，EB染色后，利用凝胶试剂盒回收目的基因片段和酶切载体；

（3）酶切产物的连接，用DNA连接酶将获得的目的基因片段及酶切载体进行连接：利用凝胶电泳回收目的基因片段和酶切载体连接体系：

注意：16℃过夜连接；

（4）连接产物的转化；连接产物转化至感受态细胞，涂布于含有卡纳霉素的LB平板于37℃培养过夜；

（5）转化产物的鉴定：经含卡纳霉素的LB平板抗性筛选、PCR鉴定、酶切鉴定，确定阳性克隆。

    但是现有的基因表达载体构建方法步骤繁琐、花费时间较长，步骤（2）中凝胶电泳、EB染色等步骤对长期从事基因表达载体构建的科研人员身体有较大危害。

发明内容

    本发明为了弥补现有的基因表达载体构建方法存在的缺陷，提供了一种快速的基因表达载体构建连接方法。

    本发明是通过以下技术方案实现的：一种快速的基因表达载体构建连接方法，其步骤为（1）酶切基因：酶切体系Ⅰ：含有目的基因的T克隆载体经限制性内切酶消化，酶切体系Ⅱ：转基因载体经限制性内切酶消化；（2）回收获得目的基因片段及酶切载体；（3）酶切产物的连接；（4）连接产物的转化；（5）转化产物的鉴定；所述的步骤（2）回收获得目的基因片段及酶切载体的步骤为：步骤（1）的酶切体系Ⅰ、Ⅱ中分别加入体积为酶切体系Ⅰ、Ⅱ3～5倍的无水乙醇，均在-20～-80℃环境下放置0.5～1h，随后12000～13000rpm离心沉淀5～10min，弃上清，真空干燥，加入20μl-30μl的pH8.0的TE缓冲液重新溶解，分别电泳检测目的基因片段及酶切载体浓度。

    本发明所述的快速的基因表达载体构建连接方法简单方便、实用性强，替换了凝胶电泳、EB染色等步骤，提高了科研人员的安全性，提高了工作效率，减少了试验环节所需费用，并能够有效地减少试验用EB对水资源等环境的污染。

具体实施方式

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程、方法、仪器、试剂是本领域公知的常规方法。步骤（1）、（3）、（4）、（5）的具体步骤是为了更好的理解本发明，为本领域常规步骤及实施方法。

实施例1

一种快速的基因表达载体构建连接方法，其步骤为：（1）酶切基因：利用XbaⅠ和BamHⅠ分别酶切有目的基因的Pmd-18T克隆载体和PBI121 vector，

酶切体系Ⅰ如下：

注：37℃充分酶切2小时；

酶切体系Ⅱ如下：

  注：37℃充分酶切2小时；

（2）回收获得目的基因片段及酶切载体：步骤（1）的酶切体系Ⅰ、Ⅱ中分别加入体积为酶切体系Ⅰ、Ⅱ4倍的无水乙醇，均在-20℃环境下放置0.6h，随后12000rpm离心沉淀7min，弃上清，真空干燥，加入30μl的pH8.0的TE缓冲液重新溶解，分别电泳检测目的基因片段及酶切载体浓度；

（3）酶切产物的连接：用DNA连接酶将制备好的载体与目的基因进行连接，连接体系如下：

注：16℃过夜连接；

（4）连接产物的转化：将过夜连接产物加入到100μl的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，放入预加温到42℃的循环水浴中热击90s，立刻转移到冰浴中，使细胞冷却2min；加800的LB培养基，转移到37℃摇床以160r/min培养2h，转化菌转移到含有卡纳霉素的抗性培养基的LB平板，37℃静置培养过夜； 

（5）转化产物的鉴定：经含卡纳霉素的LB平板抗性筛选、PCR鉴定、酶切鉴定，确定阳性克隆。