[发明专利]一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗

说明书

技术领域

本发明属于宫颈癌预防疫苗技术领域，涉及一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗。

背景技术

由于多数微生物感染发生在粘膜，机体在粘膜免疫组织诱导产生保护性体液免疫和细胞免疫反应，通过非粘膜免疫途径的疫苗难以诱导有效的粘膜免疫反应，理想的粘膜系统保护性抗原运输载体的研究成为疫苗研究中的重点。

已有报道利用减毒肠道或肠道相关组织生长繁殖的细菌和病毒，能够较有效地刺激局部和系统免疫反应。如应用减毒沙门氏菌体作为载体菌，表达外源保护性抗原，但尚不足以解决外源基因的稳定性和载体安全性问题。

宫颈癌是世界范围内仅次于乳腺癌的妇女恶性肿瘤，临床和分子流行病学研究已经证实高危型人乳头瘤病毒（HPV）是宫颈癌和宫颈不典型增生的主要始动因子，90%以上的宫颈癌标本中可捡出HPV，其中HPV16占50％以上，其余部分主要与HPV18、31、45有关；HPV6、11为尖锐湿疣等良性肛生殖区粘膜增生性病变的主要病因，因此，预防HPV感染是降低宫颈癌及其它HPV相关性肿瘤的最为适宜的策略，而应用HPV疫苗是预防HPV感染的最佳途径。

目前HPV预防性疫苗的研究主要集中于基因工程病毒样颗粒（virus-like particles VLP）疫苗。但是由于种种内在缺陷，基于减毒活细菌载体的HPV疫苗作为最具代表性的第二代疫苗越来越多地受到了研究者们的青睐。首先，相对简单的制备过程和运输过程大大降低了疫苗生产和使用成本，与VLP疫苗高昂的接种费用相比，更有可能在包括中国在内的发展中国家里推广；其次，与VLP疫苗的肌肉注射免疫相比，经口或者其他粘膜免疫途径的非侵入式免疫途径更容易被以青少年为主的免疫人群所接受。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗，将外源HPV的抗原蛋白整合入肠道菌自转运蛋白中实现抗原基因在载体基因组中的稳定存在和抗原的表面递呈，从而开发能够诱导有效粘膜免疫反应的疫苗。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种用于同源重组的icsA自转运载体，包括N1-外源序列-C2的基因片段，其中N1为表达IcsA的氨基酸转膜信号肽的N1序列，C2为表达IcsA羧基端β区域的C2序列，N1序列和C2序列之间为表达外源性抗原的序列；N1序列、C2序列的上游和下游均设有同源序列。

所述的N1序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；C2序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的外源性序列为HPV16 L1的基因序列。

所述的N1序列与HPV16 L1之间设有同源序列ctagaactat gagcct，HPV16L1与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccgg ggatc，C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcg。

所述的N1-外源序列-C2的基因片段克隆于pUC19载体的多克隆位点之间，构成pUC19-icsA-L1载体；

或者克隆于pJCB12载体的多克隆位点之间，构成pJCB12-icsA-L1载体。

一种基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，以具有自转运蛋白穿膜运载体系的革兰氏阴性肠道菌作为宿主细胞，通过同源重组，将自转运蛋白基因的表达氨基酸转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的表达功能蛋白的序列替换为表达外源性抗原的序列；

所述的革兰氏阴性肠道菌包括志贺氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌。

所述的宿主细胞为野生型宋氏志贺氏杆菌，通过同源重组，将HPV16 L1基因序列替代icsA基因中第863～1518bp的序列。

所述的HPV16 L1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，而IcsA基因中第863～1518bp的序列表达IcsA蛋白的第105～506位氨基酸的α结构域。

所述的同源重组为：