[发明专利]一种用于同源重组的自转运载体及其构建的经粘膜免疫疫苗

权利要求书

1.一种用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，包括N1-外源序列-C2的基因片段，其中N1为表达IcsA的氨基酸转膜信号肽的N1序列，C2为表达IcsA羧基端β区域的C2序列，N1序列和C2序列之间为表达外源性抗原的序列；N1序列、C2序列的上游和下游均设有同源序列。

2.如权利要求1所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的N1序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；C2序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.如权利要求1所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的外源性序列为HPV16 L1的基因序列。

4.如权利要求3所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的N1序列与HPV16 L1之间设有同源序列ctagaactat gagcct，HPV16 L1与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccgg ggatc，C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcg。

5.如权利要求1所述的用于同源重组的icsA自转运载体，其特征在于，所述的N1-外源序列-C2的基因片段克隆于pUC19载体的多克隆位点之间，构成pUC19-icsA-L1载体；

或者克隆于pJCB12载体的多克隆位点之间，构成pJCB12-icsA-L1载体。

6.一种基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，以具有自转运蛋白穿膜运载体系的革兰氏阴性肠道菌作为宿主细胞，通过同源重组，将自转运蛋白基因的表达氨基酸转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的表达功能蛋白的序列替换为表达外源性抗原的序列；

所述的革兰氏阴性肠道菌包括志贺氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌。

7.如权利要求6所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的宿主细胞为野生型宋氏志贺氏杆菌，通过同源重组，将HPV16 L1基因序列替代icsA基因中第863～1518bp的序列。

8.如权利要求6所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的HPV16 L1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，而IcsA基因中第863～1518bp的序列表达IcsA蛋白的第105～506位氨基酸的α结构域。

9.如权利要求6所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的同源重组为：

以电穿孔方式转化有pJCB12-icsA-L1载体的SM10λpir作为同源重组供体菌；所述的pJCB12-icsA-L1载体是将N1-HPV16 L1-C2的基因片段克隆于pJCB12载体的多克隆位点之间，N1序列与HPV16 L1之间设有同源序列ctagaactat gagcct，HPV16 L1与C2序列之间设有同源序列ggaagctgag tactat；N1序列的前端还设有同源序列cggtacccgg ggatc，C2序列的后端还设有同源序列gatcctctag agtcg；

以具有链霉素抗性的野生型志贺氏杆菌作为同源重组受体菌；

将同源重组供体菌与同源重组受体菌混合后，在LB琼脂平板上于37℃培养箱中培养12～16，使同源重组供体菌与同源重组受体菌之间充分发生接合，进而发生第一次同源重组，使pJCB12载体整合进入志贺氏杆菌基因组中；

筛选第一次同源重组的阳性菌落后，以5%蔗糖为选择压力诱导第二次同源重组，剔除其余载体而保留两侧同源序列之间的HPV16 L1基因序列，使HPV16 L1基因整合进入icsA基因，替代转膜信号肽与羧基端转膜区域之间的序列。

10.权利要求7所述的基于自转运蛋白重组的粘膜免疫疫苗在制备抗宫颈癌的药物或疫苗中的应用。