[发明专利]TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。

背景技术

随着全球能源和环境危机的日益恶化，寻找新的可再生能源已成为当前社会关注的热点问题，纤维素生物质作为植物吸收太阳能并通过光合作用形成的产物，是地球上最为丰富的、最可行的可再生新能源物质。但如何将生物质转化成现代工业可利用的能源物质却存在诸多问题，其中最关键问题就是实现天然生物质的高效降解。纤维素酶是自然界中存在最广泛、最有效的生物质降解酶，在木质纤维素资源转化过程起着关键性作用，其产量、活性的高低直接关系着新的生物质能源的开发、利用。

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)是主要的纤维素酶生产菌株，全球大约90%以上纤维素酶产品是通过木霉发酵生成的。五十年来，人们通过优化培养条件、基因突变和菌株诱变等方法使里氏木霉生产纤维素酶的能力获得大幅提高。但是，生产纤维素酶成本高、产量低仍是制约生物质能源不能规模化的瓶颈。通过传统方法进一步提高纤维素酶产量已经非常困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。

本发明提供了一种构建工程菌的方法，包括如下步骤：抑制木霉中TrMAK基因的表达，得到工程菌；所述TrMAK基因编码如下（a）或（b）所述的TrMAK蛋白：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列1衍生的蛋白质。

所述TrMAK基因为如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2所示的DNA分子；

2）序列表的序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述“抑制木霉中TrMAK基因的表达”的实现方法如下：通过同源重组敲除木霉中的所述TrMAK基因。

所述“通过同源重组敲除木霉中的所述TrMAK基因”的实现方法如下：将含有DNA片段甲的重组质粒导入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrMAK基因的上游同源臂和所述TrMAK基因的下游同源臂。

所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还具有筛选标记基因。所述筛选标记基因具体可为pyr4基因；所述pyr4基因为编码序列表的序列5所示的pyr4蛋白的基因。所述pyr4基因具体可如序列表的序列4自5’末端第1380至2525位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可依次包括所述上游同源臂、所述pyr4基因的表达盒和所述下游同源臂。所述上游同源臂具体可如序列表的序列4自5’末端第7至1006位核苷酸所示。所述下游同源臂具体可如序列表的序列4自5’末端第2937至3936位核苷酸所示。所述pyr4基因的表达盒具体可如序列表的序列4自5’末端第1013至2930位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可为序列表的序列4自5’末端第7至3936位核苷酸所示的双链DNA分子。

所述含有DNA片段甲的重组质粒具体可为将所述DNA片段甲导入质粒pBluescript SK(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

所述木霉可为里氏木霉，具体可为TU6△tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。

以上任一所述方法得到的工程菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：发酵所述工程菌，得到纤维素酶。所述发酵的具体条件为，将所述工程菌接种于发酵培养基，28℃，200rpm震荡培养48-144小时。

本发明还保护抑制所述TrMAK基因表达的物质在促进木霉生产纤维素酶中的应用。所述抑制所述TrMAK基因表达的物质为含有以上任一所述DNA片段甲的重组质粒。所述抑制所述TrMAK基因表达的物质具体可为将所述DNA片段甲导入质粒pBluescript SK(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

所述木霉可为里氏木霉，具体可为TU6△tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。