[发明专利]固相合成胸腺肽α1的20肽阶段的缺失肽、非肽杂质及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及固相合成胸腺肽α1中的缺失肽、非肽杂质及检测方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α1的20肽阶段的缺失肽、非肽杂质及检测方法，属于固相合成胸腺肽α1领域。 

背景技术

胸腺肽α1是从胸腺素组分5(TF-5)中分离出的一种活性多肽，由28个氨基酸残基组成，分子量为3108.37。在TF-5中，胸腺肽α1的含量为0.6％，是人体胸腺激素的重要活性组分。例如胸腺肽α1可调节T淋巴细胞发育、分化和成熟。此外，胸腺肽α1能修复受损的T淋巴细胞。虽然从TF-5中分离的胸腺肽α1无明显毒副反应，但由人工固相合成的市售胸腺肽α1可因不纯而造成不良反应。 

目前，人工固相合成胸腺肽α1的操作规程千篇一律，几乎没有优化空间。市售的保护氨基酸和相关试剂的纯度也足以支持人工固相合成高纯度胸腺肽α1。在操作规程不出差错的前提下，人工固相合成的胸腺肽α1是否纯，取决于它含的缺失肽的状况。 

与小分子药物不同，多肽的生物活性非常强。在人工固相合成的胸腺肽α1中，即使存在微量的缺失肽也可造成严重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α1的质量的关键是控制缺失肽。目前国内外既没有披露人工固相合成的胸腺肽α1中的缺失肽状况，也没有公开测定人工固相合成的胸腺肽α1中的缺失肽的方法。这种状态不适应胸腺肽α1的临床地位。为了改善这种状况，保障胸腺肽α1的临床用药安全性，形成了本发明。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够准确、灵敏的检测固相合成胸腺肽α1的20肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质的方法； 

本发明的另一个目的是提供固相合成胸腺肽α1的20肽阶段的缺失肽谱； 

本发明的目的之三是将固相合成胸腺肽α1的20肽阶段的缺失肽谱应用于胸腺肽α1固相合成中的质量控制。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种检测固相合成胸腺肽α1的20肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质的方法，包括以下步骤：将固相合成胸腺肽α1过程中的20肽采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在16.69min时出现峰面积为2.27％的离子流峰、在17.78min，时出现峰面积为1.65％的离子流峰、在18.47min时出现峰面积为2.18％的离子流峰、在19.54min时出现峰面积为5.79％的离子流峰、在23.18min时出现峰面积为7.57％的离子流峰或者在24.65min时出现峰面积为2.39％的离子流峰；说明固相合成胸腺肽α1的20肽阶段中含有缺失肽；如果在15.11min时出现峰面积为1.46％的离子流峰或在16.12min出现峰面积为2.18％的离子流峰，则说明固相合成胸腺肽α1的20肽阶段中含有非肽杂质。 

本发明所述的胸腺肽α1的20肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。 

所述的梯度洗脱优选为：用0.1％甲酸/乙腈梯度洗脱，流速为0.8ml/min，梯度为：0-5min，0.1％甲酸/乙腈＝97/3；5-35min，0.1％甲酸/乙腈＝75/25。 

本发明方法中LC/MS联用仪中的LC采用Agilent 1200自动进样，Waters Xterra RP18分析柱的规格为5μm，3.0×150mm；LC/MS联用仪中的MS采用Bruker Solatix FT-ICR-MS，离子流检测器。 

本发明进一步提供了固相合成胸腺肽α1的20肽阶段的缺失肽谱，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示； 

本发明所提供的缺失肽谱或非肽杂质作为胸腺肽α1固相合成中的质量控制物，应用于提高固相合成胸腺肽α1的质量或纯度。 

本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出固相合成胸腺肽α1的20肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质，可以有效地保障和控制胸腺肽α1的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α1中有重要应用价值。 

附图说明

图1胸腺肽α1的二十肽片段Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的离子流。