[发明专利]扩张性心肌病易感性检测试剂盒（CTLA4等基因）

说明书

技术领域

本项目属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种扩张性心肌病易感基因无创检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估人群中扩张性心肌病的遗传易感性的风险级别，并作为人类预防和治疗扩张性心肌病的方向指导。 

背景技术

扩张型心肌病(Dilatedcardiomyopathy，DCM)是最常见的心肌病，也是心力衰竭的主要病因之一。DCM是一种以心腔(左心室和/或右心室)扩大、心肌收缩功能障碍为主要特征的心肌疾病，研究发现其发病机制主要与家族或遗传性有密切联系。其发病年龄为20～50岁，男性居多，在我国发病率为13/10万～84/10万左右，约20%的DCM患者有家族病史，5年存活率不到50％，预后很差。所以必须高度重视该病的危害，及早进行预防和治疗。 

DCM的发生是一个涉及多基因、多环节和多途径的过程。DCM的发生可能是众多致病因素共同作用的结果，目前科学家普遍认为遗传因素在DCM发病中起着至关重要的作用。 

国内外研究证实，DCM发病机制与T细胞免疫应答有很大联系。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4，CTLA-4）基因有3个多态位点：启动子318位点C/T；外显子1第17密码子49位点A/G；外显子4的3'非翻译区642位点二核苷酸（AT）n微卫星。其中A49-G多态性与DCM发生有密切关系。研究发现，CTLA-4基因外显子A49-G多态性与DCM易感性相关，携带G等位基因者易患DCM，其机制可能为该多态性造成CTLA-4信号肽中编码苏氨酸和甘氨酸的替换，从而影响蛋白翻译后加工、修饰，使sCTLA-4功能发生变化。荷兰医学家研究同样表明，CTLA-4基因第一外显子第49位碱基多态性改变可导致蛋白前导肽链第17位苏氨酸与丙氨酸互换。同时他们研究证实，CTLA-4 基因A49-G多态性中, 等位基因G多与扩张性心肌病有关。 

CTLA-4基因第一肿瘤坏死因子（Tumor necrosis fator，TNF）是一种重要的细胞因子，主要分为TNF-α与TNF-β两种。TNF-α基因具有多态性，目前已经明确-308位点具有多态性，这主要是由第308位点碱基G变异为A导致的。有研究认为-308位点G-A的碱基变化可直接影响转录水平。Louis等人研究了基因-308位点多态性对转录的影响，发现A等位基因携带者的TNF-α产量比G等位基因纯合子高，认为308位点碱基突变影响了TNF-α的产量。Kroeger等人的研究发现TNF-α基因-308位点的A等位基因比G等位基因的转录活性高两倍。 

肿瘤坏死因子-β(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-β)基因第一内含子+252位点存在G/A多态性，可能与TNF的表达相关，并可能与DCM疾病的发生、发展相关。有研究表明，DCM患者TNF-β基因+252位点携带A等位基因频率明显高于正常人，提示该位点的多态性可能是DCM发生、发展的遗传因素。 

因此，建立简单、快速的DCM易感基因无创检测方法，能够检测出DCM发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出DCM的高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于降低DCM的发病率具有重要意义。 

  

发明内容

基于 CTLA4基因上A49G（rs231775）、TNF-α基因上G-308A (rs1800629)、TNF-β基因上A252G rs909253)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估扩张性心肌病发病风险级别，本发明提供一种扩张性心肌病基因无创检测试剂盒。 

该试剂盒包括： 

检测 CTLA4基因上A49G（rs231775）、TNF-α基因上G-308A (rs1800629)、TNF-β基因上A252G rs909253)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；

PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH₂O等）；

PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH₂O等）；

DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH₂O等）。

本发明试剂盒的组分和含量包括：