[发明专利]一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法及其用途

权利要求书

1.一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定；

（2）NFIC慢病毒载体的构建；

（3）NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系；

（4）将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育。

2.根据权利要求1所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定；其具体为：首先，取新鲜拔除的人第三磨牙牙根，取其根尖牙乳头组织，采用胶原酶消化法原代培养，细胞培养液为含体积比为20%胎牛血清的α-MEM，培养根尖牙乳头细胞；然后，将培养出的根尖牙乳头细胞单克隆、筛选，扩大培养后获得根尖牙乳头干细胞；最后，将根尖牙乳头干细胞通过单克隆抗体STRO-1鉴定，流式细胞仪分析细胞表型。

3.根据权利要求1所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中过NFIC慢病毒载体的构建，其具体为：首先，克隆人的NFIC全长序列，连接入入门载体p-ENTR，构建p-ENTR-NFIC，测序鉴定；然后，将p-ENTR-NFIC与慢病毒表达质粒pLenti6.3/v5-DEST重组反应，构建真核表达载体pLenti6.3/v5-NFIC，测序鉴定。

4.根据权利要求1所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系，具体为：用真核表达载体pLenti6.3/v5-NFIC转染根尖牙乳头干细胞，用抗生素Blasticidin以4ug/ml的浓度筛选一周，以获得稳定转染NFIC的根尖牙乳头干细胞系，将其密度调整至1×10⁶/ml，在矿化诱导液中培养1周，所述矿化诱导液为含有体积比为10%胎牛血清和浓度比50mg/L维生素C的α-MEM培养液。

5.根据权利要求1所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育，具体为：对矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系，用无菌刀片沿培养皿边缘将其整张膜片掀起，离心后，倒上清，加入α-MEM浸润，吹打后，与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料37℃共孵育2h，离心。

6.根据权利要求1所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述组织工程化人牙根植入材料在人牙根制备中的用途。

7.人的NFIC全长序列在促进根尖牙乳头干细胞矿化中的用途。