[发明专利]一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用，是一种利用乙醇提取鲨鱼醇溶性蛋白的方法及利用酶工程技术和色谱技术制备高抗氧化活性醇溶蛋白肽的方法。

背景技术

近年来，由于化学抗氧化添加剂的不安全性和食品安全的考虑，化学抗氧化添加剂如BHA（丁基羟基茴香醚）、BHT（2,6-二叔羟基对甲酚）和TBHQ（特丁基对苯二酚）等的应用受到了较大限制。因此，高效、低毒的天然食品抗氧化剂的开发成为研究热点领域。

目前，已从各种植物、动物组织中提取得到了抗氧化活性显著的物质，如茶叶中的茶多酚、大豆中的异黄酮、枸杞中的多糖等物质。而已有的研究发现，生物体内天然多肽也具有显著的抗氧化活性，如存在于肌肉组织中的肌肽不仅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品贮藏时有护色作用。另外，以生物蛋白为原料，采用酶解技术得到的酶解物及其组成多肽也具有显著的抗氧化活性。如张学忠等发现大豆酶解多肽具有清除超氧阴离子自由基，减少人体红细胞氧化溶血程度以及抑制脂质氧化导致的脂质体膜的破坏；徐怀德等研究发现甲鱼蛋白的木瓜蛋白酶酶解产物可清除羟基自由基和超氧阴离子自由基和DPPH自由基。

醇溶蛋白早在18世纪末就被人们发现，是植物种子储存蛋白的组分之一。不溶于水，可溶于50%～90%乙醇。由于醇溶蛋白为单链蛋白，单肽通过氢键和疏水键相互作用，这两种键的键能较低，容易被“打断”，所以醇溶蛋白使面筋具有黏性和延伸性，在食品保鲜、药品缓释剂、美容护肤等方面具有较大用途。但是目前尚未有关于动物醇溶蛋白的报道。

申请人在实验中发现，路氏双髻鲨鱼肉中含有大量的醇溶蛋白，且醇溶蛋白的酶解产物具有较好的抗氧化活性，而文献检索发现以鲨鱼肉为原料提取制备醇溶蛋白，利用酶解技术和色谱技术制备醇溶蛋白抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段，而鲨鱼醇溶蛋白肽在清除自由基和抑制脂质过氧化方面的应用更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽，具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的制备方法，利用酶解技术和色谱技术进行制备，工艺科学合理、易操作。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽，其特征在于氨基酸序列分别为Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 476.40[M+H]⁺或者/和m/z 668.60[M+H]⁺。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤依次为：

1）以鲨鱼醇溶蛋白作为原料，按固液比1g:5mL~1g:10mL，加入pH5~6磷酸盐缓冲液，用HCl或NaOH调pH到5~7，得混合液；

2）将混合液温度升至50~60℃搅拌预热15min~20min，按照醇溶蛋白质量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为50~60℃，酶解时间1~3h；

3）将酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。

作为优选，所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×10⁶U/g。

作为改进，所述步骤3）中的灭酶处理为：将步骤2）所得的酶解产物升温至90~100℃，并于此温度保持10min~15min，再冷却至10~20℃以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。

作为改进，所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：

脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度60~80%乙醇进行解析，除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；

超滤：将脱盐酶解物干粉溶于pH6.8~7.2磷酸盐缓冲液配成8~12mg/mL的溶液，于0.1MPa~0.15MPa的工作压力和20℃~30℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液；