[发明专利]甲型H1N1流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种甲型H1N1流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、H1N1(2009)检测引物T7引物和nT7引物、H1N1(2009)检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检测拭子中的H1N1(2009)RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达100copies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规50分钟完成检测)的特点，将在甲型H1N1流感早期感染的临床诊断中发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的甲型H1N1流感病毒(2009)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

流感病毒根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成，根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型。

甲型流感病毒为常见流感病毒，易变异，最具攻击力。可引起人的流感并有时引起肺炎和其他并发症，主要是气管和支气管纤毛柱状上皮细胞的坏死和脱落，有些病毒株能自然感染禽类和哺乳类动物。具有突然暴发，迅速蔓延，广泛流行的特点。世界范围的流感大流行共发生4次，其中1918-1919年世界大流行导致2000万人死亡。中国近半个世纪以来流感流行共计发生18次，其中3次为大流行。

甲型H1N1流感病毒(2009)属正粘液病毒科甲型流感病毒属，典型病毒呈球状。2009年3月，墨西哥爆发H1N1疫潮，导致百人感染。疫情迅速传播到全世界。世界卫生组织把全球流感大流行警告级别提高到第5级。该流感是由A型流感病毒引起的猪呼吸道传染病，毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的脱氧核糖核酸基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。虽然猪体内已发现甲型H1N1流感病毒(2009)，但目前尚无证据表明动物为传染源。少数病例病情进展迅速，出现呼吸衰竭、多脏器功能不全或衰竭，甚至死亡。甲型H1N1流感病毒可直接从猪传染给人，亦可出现人际间传播，引起世界性大流行，是危害人类健康的一种重大疾病。

目前常用的甲型H1N1流感病毒的实验室检查方法包括：1)免疫学检测方法，如快速流感抗原检测、免疫荧光法(或装配的IFA)，此法对操作者要求较高；2)细胞生物学检测方法，常用有鸡胚接种法和细胞培养法。此法对病毒分离法较敏感，但需要2-3周时间，无法实现早起快速诊断。3)分子生物学检测方法。目前有逆转录酶-聚合酶链式反应(ReverseTranscriptase-PCR，简称RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real TimeFluorescent Quantified PCR，简称FQ PCR)，RT-PCR采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式，易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象。实时荧光定量PCR虽在技术上解决了上述问题，其灵敏度和准确度较高，但操作复杂，检测成本相对昂贵，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，核酸扩增和检测使用M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。此SAT技术前期已由申请人申请专利并授权(ZL200810111479.0)，结合利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(ZL200810111478.6)，发明人制备了甲型H1N1流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。