[发明专利]具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基因治疗技术领域,特别涉及一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺阳离子高分子的基因载体及其制备方法,阳离子高分子与DNA结合后，有效实现内涵体逃逸，递送DNA进入细胞表达相关蛋白质，实现基因治疗。

背景技术

随着基因治疗研究的不断深入，尤其是基因治疗临床实验的广泛开展，人们越来越认识到选择恰当的载体，使目的基因靶向、可控并有效地表达，是基因治疗成功的关键。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viral vector）和非病毒载体（non-viral vector）两种。病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，转染效率高且对大多数细胞都有靶向作用，已被广泛而有效地得到了应用。但是其携带的DNA大小有限，而且病毒载体能引起免疫原性反应、致癌性以及能任意地整合到主体的基因组当中，存在着很大的安全隐患。而非病毒载体具有合成简单、可以携带大容量的遗传物质、无免疫原性等诸多优点，因此非病毒载体的研究倍受人们的重视（Mintzer MA,Simanek EE.Chem.Rev.2009,109,259-302;Morille M,Passirani C,Vonarbourg A,Clavreul A,Benoit JP.Biomaterials.2008,29,3477-3496）。

到目前为止，研究者们已设计了多种类型且各有特点的非病毒基因载体，其中，阳离子高分子由于具有安全性高，免疫原性低，易于对DNA进行操作，价格低，特别是其结构易于改造等优点，因此人们对阳离子聚合物作为基因载体的兴趣越来越高，基于阳离子聚合物载体的基因传递方式已经被广泛应用于人类遗传病和其他疾病的基因治疗研究。虽然这些阳离子载体具有极低的免疫原性，但是较低的转染效率和瞬时蛋白表达成为这类载体用于基因治疗中的最大障碍。因此如何提高阳离子聚合物基因传递体系的基因转染效率成为当前非病毒基因传递体系研究的热点问题之一。

众多的聚阳离子中，聚乙烯亚胺PEI由于极高的正电荷密度，可以和DNA形成紧密的络合体，因此引起了研究者极大的兴趣，使其成为近年来体内外细胞转染中研究最广、转染效率最高的合成载体。PEI较高的正电荷密度一方面赋予了其较高的转染效率，但同时赋予了其较大的细胞毒性，限制了其应用。为了降低PEI的细胞毒性，一些研究组从生物相容性考虑，设计合成了多种低毒性的PEI衍生物（Petersen H,Merdan T,Kunath K,Fischer D,Kissel T.Bioconjugate Chem.2002,13:812-821;Gosselin MA,Guo WJ,Lee RJ.Bioconjugate Chem.2001,12:989-994）。

发明内容

本发明所要解决的问题在于克服现有技术中聚乙烯亚胺的基因载体毒性较高的缺陷，提供一种具有高缓冲能力、高转染效率的基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法。

本发明的所要解决的又一问题，在于提供具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体。

本发明的所要解决的又一问题，在于提供上述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的应用。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明第一方面提供的技术方案是：具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

（1）取聚乙烯亚胺溶于无水甲醇，加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺,聚乙烯亚胺：N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为4：0.77，通往氩气保护，反应过夜；

（2）将反应液置于RC膜透析袋中，其截留分子量为3500，超纯水透析5-8天，冻干得到黄色油状固体，即为制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子（MBA-PEI），保存在干燥器中。

优选地，所述聚乙烯亚胺分子量为423Da-1800Da。

优选地，所述聚乙烯亚胺分子量为800Da。

优选地，所述步骤（1）中反应温度为25-100°C

优选地，所述步骤（1）中反应温度为50℃。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明第二方面提供的技术方案是：提供上述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体，如下化学式I：

其中，X为6-210；Y为6-210。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明第三方面提供的技术方案是：具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体在基因治疗中的应用。