[发明专利]一种肿瘤用药个体化指导的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成 本低的肿瘤用药个体化指导的检测方法。

背景技术

目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对特异性靶基 因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点是灵敏性高， 并可精确定量，在对EGFR，BRAF，KRAS等的检测中都取得了良好效果。利用特异引物对突变 靶序列进行高精准PCR扩增放大，并利用一种新型探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样 品DNA中突变的检测，具有很高的特异性和敏感度。其中目前在肿瘤个体化分子诊断领域最 重要的EGFR、KRAS、BRAF三种基因突变检测试剂产品已获得SFDA《医疗器械注册证》和欧 盟CE认证。荧光定量PCR的缺点：通量低，一次只能检测一个基因，如需要检测多种相关 基因突变，SNP，表达情况，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长；成本相对较高： 因一次只能检测一个基因位点，当一个样品同时需要检测多种肿瘤相关基因时，必须一个一 个检测，成本相对增高；不适用于检测固定包埋后的病理组织，但患者可供的多数是固定后 的组织；只能设定一个内参基因(管家基因)，但肿瘤组织的管家基因有别于正常组织，需 要一组管家基因作内参；只能同步检测最多三种基因，但个体化治疗需要同步检测十几种甚 至更多的基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的肿瘤用 药个体化指导的检测方法。

本发明采用如下技术方案：

一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，包括如下步骤：(1)采集患者样品，并提取 核酸；(2)以患者核酸为模板进行反转录；(3)以反转录产物为模板进行PCR反应；(4) 以毛细电泳的方法分离样品。

优选地，所述步骤(1)中的患者样品包括新鲜、冰冻肿瘤组织等等。

优选地，所述步骤(2)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温 度下孵育的子步骤。

优选地，所述步骤(2)中的孵育温度分别为48℃、42℃、95℃、4℃。

优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温 度进行热循环反应的子步骤。

优选地，所述步骤(3)的子步骤中的热循环温度分别为95℃、94℃、55℃、70℃、4 ℃。

本发明的有益效果为：

1.灵敏度高、重复性好：采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。

2.准确性强：采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、 引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。

3.高通量：本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检 测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测11 个相关基因)，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。

4.精确定量：可精确定量基因突变，SNP，表达拷贝数。

5.灵活性强：可随时根据需求调整检测的靶基因，例如新发现的靶向位点，可立即 设计特异性引物，将其放入“肿瘤个体化治疗用药指导多重基因检测方案”中去。

6.成本低：每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。本发明创立了一种同步检测11种常见肿 瘤个体化治疗相关基因的多重基因检测方案。检测步骤：采集患者样品(新鲜，冰冻组织等)， 提取核酸，以患者核酸为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品。

1.检测的基因及内容包括(表1)。

2.建立了可靠地样品质量及反应过程的对照(表1)

a)人RNA完整性的对照内参：确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假 阴性。

b)正常反应对照内参：监控PCR反应效率，避免假阴性。

表1：

3.肿瘤个体化治疗多重基因检测的引物设计(见表2核苷酸序列)