[发明专利]基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条及其制备方法和应用，属于免疫试纸技术领域。

背景技术

免疫分析法是基于抗原与相应抗体间免疫结合反应，即利用抗体(或抗原)作为选择性试剂来测定抗原、半抗原(或抗体)的方法。抗体与抗原间反应有极高的特异性，从而对免疫分析样品不需或仅需简单的预处理。抗体-抗原复合物有较高的稳定性，其稳定常数一般为10⁹，甚至可达10¹⁵。遗憾的是，虽然抗体-抗原结合可显示某种催化特性，但从分析测试的角度考虑，免疫反应缺乏使用高灵敏性试剂所具备的分析信号反差，难以直接检测。因此，免疫反应必须通过与放射性同位素示踪、荧光或化学发光标记等高灵敏的标记技术相结合，才能使其既具有极高的选择性，又具有极高的灵敏度。标记物的性质决定了信号检测的方法和其检测灵敏度，同时也影响和限制着测试方式的选择。根据标记物性质的不同，免疫分析法分为放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等。由于荧光检测可以达到很高的灵敏度，又无放射性污染等环境问题，在免疫分析中占有十分重要的地位。为解决FIA受来自样品(特别是生物试样)较强且变化大的荧光背景，以及散射等因素的干扰问题，促进了长寿命、长波长荧光标记试剂(如镧系金属螯合物、卟啉类化合物)的合成和时间分辨荧光技术的发展，目前非同位素标记分析的灵敏度已达到或超过放射免疫分析方法。磷光分析法是荧光分析法的姊妹技术，相对于荧光，它又有其很多独特的优越性：(1)有大的Stokes位移，磷光的波长比荧光的波长长，和激发光谱离得较远，不会和激发光谱重叠，不仅可减少或消除试样(特别是生物试样)本底荧光和入射激发光的干扰，自吸收现象也有减轻；(2)由于T₁→S₀自旋禁阻，磷光的寿命比荧光长，磷光的寿命约为10^-3～10s，易于实现时间分辨测定；(3)选择性更好。但到目前，磷光免疫分析并未得到应有的发展。究其原因，主要受到磷光发光材料的限制，尤其是水溶性高，生物相容性好的磷光发光材料的缺乏，故未开发一种既适合于免疫分析，又能显示磷光检测优势的磷光技术。

尽管荧光免疫分析的研究和应用取得了广泛而深入的进展，但就磷光免疫分析而言，国内外尚都处于起步阶段。适于抗体(抗原)标记的、高发光效率磷光标记物的开发，是实现磷光免疫分析四个环节(抗体生产、标记试剂的选择、抗体(原)的标记、分析方式设计和分析信号检测)中最关键的环节。用于磷光免疫分析标记的试剂有三种：一是高发光量子产率的荧光试剂(如异硫氰酸荧光素FITC)；二是镧系元素(Eu、Tb、Sm、Gd和Dy等)离子与某些配体(如4，7-二苯基-1，10-菲罗啉二磺酸等)所形成的螯合物作为磷光标记物，发光波长处于长波，并有很长的发光寿命，能有效避开生物流体本底荧光的干扰，而且有很高的灵敏度。三是金属卟啉，特别是贵金属铂、钯的卟啉类化合物。金属卟啉是自然界中广泛存在的一类大环化合物，如血红素、叶绿素、VB12等，它们在生命体的新陈代谢以及很多基本生物过程中都起着不可忽视的作用。卟啉分子由四个吡咯环通过次甲基连结，形成一四配位卟啉核。卟啉环非常稳定，可与直径为3.7埃的金属发生配位；它与过渡态金属形成的络合物尤其稳定，比如，Zn-四苯基卟啉(ZnTPP)，其稳定常数为10²⁹。大部分金属都与卟啉形成1∶1的络合物，只有Na、K、Li络合物的配合比为2∶1，两个金属原子分别位于卟啉环平面的上方和下方。如图1所示，描述了卟啉能量跃迁产生磷光的原理。卟啉的电子吸收光谱主要有Soret带(又称B带)和Q带。Soret带位于400～450nm之间，摩尔吸光系数高(2～5×10⁵mol^-1.L.cm^-1)。而金属卟啉的Soret带吸收较弱，当环侧有亲电子基团时，Soret带将向长波方向移动。卟啉的Q带一般在450～650nm之间，有四个相关峰；当吡咯环氮上的氢被金属离子取代形成金属卟啉后，四个相关峰减弱或消失。卟啉和金属卟啉由于具有18电子大π离域结构，所以，以其B带或Q带作为激发波长，均在600～700nm间(或更长的波长范围)有不同程度的荧光发射；一般情况下，金属卟啉的荧光强度要弱于卟啉。室温下，卟啉本身不发磷光，当与某些金属形成络合物并与有序介质(如表面活性剂、蛋白质和核酸等生物大分子)共存时才在近红外区发射磷光；但只有极少数的金属卟啉发磷光，最常见的为钯卟啉和铂卟啉。钯/铂卟啉具有极强的磷光，其特点是长寿命(ms)，长波长(600～1000nm)。最常见的有水溶性meso-四(4-磺酸苯基)卟啉(H₂TSPP^4-)和meso-四(4-N-三甲氨基苯基)卟啉(H₂TMAP⁴⁺)的钯/铂络合物，以及非水溶性的八乙基卟啉(OEP)和四苯基-四苯并卟啉(Ph₄TBP)的钯/铂络合物等。600～1000nm的近红外区是研究生物物质发光探针和光化学传感器的一个极为有用的区域。所以，具有特殊磷光特性的钯/铂卟啉便成为生物分析方面非常有效的探针分子，结合一些简单的检测仪器便可提供很高的灵敏度和选择性。