[发明专利]一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及牛支原体的检测与鉴定技术领域，具体涉及一种牛支原体单克隆抗体，还涉及一种分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，同时还涉及一种牛支原体单克隆抗体的制备方法，还涉及牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体中的应用。 

背景技术

在世界范围内,牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）已经成为肉牛和奶牛场一种最为常见和最为重要的病原，导致以肺炎为主的综合征侯群，包括肺炎、关节炎、房炎和结膜炎等一系列临床疾病。自1961年世界上首次在美国从患乳房炎的奶牛牛奶中分离到牛支原体以来，世界各个国家都证实该病原及相关疾病在牛群中广泛流传，极大地威胁了养牛业的健康发展（Nicholas等，2003）。 

2008年以来,湖北省从外地引进肉牛中,陆续发生呼吸道疾病,牛群引进后不久即发病,表现为发热,咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。发病率为50%～100%,病死率平均10%，可高达60%。剖检时，病理变化主要集中在胸腔，以坏死性肺炎为主，因此老百姓称其为“烂肺病”。本实验室首先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”（石磊等，2008）,随后证实该病在全国不同地方广泛流行（胡长敏等，2009；辛九庆等，2008）。由于常规抗菌药治疗效果差，且无疫苗等防控手段，给养牛业造成了严重的经济损失。 

目前用于该病的诊断方法主要是牛支原体的分离和鉴定，至少需要3天时间。常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎的灵敏度低，非特异性高。针对牛支原体的PCR和等温环介导方法方法灵敏高，但前者需要特殊仪器设备，且两种方法都容易因污染核酸而出现假阳性。因此，建立灵敏、特异的抗原检测方法将对该病的快速诊断具有重要意义，而高亲合力单克隆抗体是建立抗原检测方法的前提。虽然国外在牛支原体单克隆抗体制备方面已取得一定的进展（Rasberry等，1992），本课题组进行的基因组测序分析表明（GenBank登录号：CP002058），牛支原体是一种变异性极高的原核生物，其表面脂蛋白与国外菌株比较存在很大变异。因此，申请者以本地分离株为抗原，获得了分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用所分泌的单克隆抗体，建立了检测牛支原体抗原的双抗夹心ELISA方法，该方法将为牛支原体相关疾病的诊断提供灵敏、特异、且适合批量检测的新型检测手段。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种牛支原体单克隆抗体，该单克隆抗体特异性高，不与牛的常见病原发生交叉反应，而且能够大量生产，该单抗能够识别牛支原体的表面蛋白，为建立特异性的牛支原体双抗夹心ELISA方法建立的基础。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种牛支原体单克隆抗体的制备方法，该方法利用吡咯灭活的本地流行的牛支原体HB0801的菌体作为抗原，免疫BALB/c小鼠，避免了牛支原体表面蛋白的天然结构的破坏，使制备的单克隆抗体是针对的是牛支原体的表面蛋白的抗体，而且因为牛支原体的快速变异的特性，用本地流行株HB0801作为抗原制备的单抗比国外的牛支原体单抗更容易识别中国流行的牛支原体。另外，本研究通过多次洗涤抗原以及利用马血清作为特异性实验的对照，消除了牛支原体培养基中马血清对单抗制备的干扰，从而避免了制备的单抗出现与马血清反应的现象。 

本发明还有一个目的是在于提供了一种分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，申请人于2012年1月16日将该杂交瘤细胞送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C201218，分类命名：杂交瘤细胞株1C11。 

该杂交瘤细胞株1C11可以在含有20%（v/v）胎牛血清的RPMI-1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5%（v/v）CO₂的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗牛支原体的单克隆抗体。该细胞由骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞融合而得，染色体计数结果显示该杂交瘤细胞株染色体为90条（介于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体数目70条和BALB/c小鼠脾细胞的染色体数目40条之间）。 

本发明的再一个目的是在于提供了一种牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体中的应用，该方法为中国牛支原体相关疾病的诊断提供了灵敏、特异、且适合批量检测的新型检测手段，填补了国内牛支原体抗原检测的空白。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：