[发明专利]一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用

权利要求书

1.一种牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：杂交瘤细胞株1C11， CCTCC NO：C201218。

2.利用权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备牛支原体单克隆抗体方法，其步骤是：

1）牛支原体抗原的制备： 

牛支原体HB0801株在PPLO培养基37℃培养72 h后，取适量作计数用，剩余用0.2﹪v/v终浓度为的吡咯灭活24h，之后于12000 r／min离心30min收集菌体，再用灭菌PBS洗涤5次，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，于-20℃冻存；

2）小鼠免疫：

   将步骤1）制备的牛支原体抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后颈背部皮下多点注射免疫5只BALB/C 小鼠，分别在二周和四周后用抗原加弗氏不完全佐剂进行两次加强免疫；每次免疫7天后，尾尖采血分离血清，用间接ELISA测其效价，取效价最高的小鼠脾脏进行下一步融合；

3）杂交瘤细胞以及单抗的制备：

    杂交瘤制备：在细胞融合前三天对效价最高的小鼠进行加强免疫，三天后小鼠断颈处死，无菌取脾脏，研碎，静置3min吸取上层细胞液；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的数量比混合，用45%v/vPEG 4000介导细胞融合，逐步加入基础培养基稀释PEG，消除PEG的作用来终止融合；将融合细胞加到已有饲养细胞层的96孔培养板中，于37°C CO₂培养箱中培养；细胞培养至覆盖10～20％孔底面积时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆；杂交瘤细胞克隆采用有限稀释法，选取阳性杂交瘤克隆转接于24孔板扩大培养，并做再次克隆化筛选，连续两次克隆率达到100%后，将克隆化细胞转入培养瓶扩大培养；

单抗腹水的制备：取BALB/c小鼠，先对小鼠进行腹腔注射弗氏不完全佐剂，一周后将获得的杂交瘤细胞腹腔注射接种到小鼠腹腔内，每只老鼠约1×10⁶个杂交瘤细胞，制备腹水，约10天后可产生腹水，待小鼠腹部隆起较大时，处死小鼠，用注射器将腹水吸出，一般一只小鼠可获5～10mL腹水；    

 4）单抗纯化：含单克隆抗体的腹水用辛酸-硫酸铵法纯化，并用适当体积的pH7.4 PBS重悬沉淀，将悬液装进透析袋中，放入PBS中透析过夜，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定，即为粗提的目的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在牛支原体检测中的应用。