[发明专利]豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记和SCAR标记快速分子检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记全序列、特异性SCAR标记引物序列及豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法。

背景技术

豌豆孢囊线虫（H.goettingiana Liebscher,1892），是欧洲一些国家中侵染豌豆的主要病害。目前已在欧洲、非洲、前苏联和地中海地区有分布，美国也有报道，但是相关分布范围较小。豌豆孢囊线虫在我国的分布和传播正在调查中，目前在青海，湖北，四川等地均有为害大豆的发现。豌豆孢囊线虫的寄主主要为豆科的豌豆(PisumsativumL.)，蚕豆(Viciafaba)，野豌豆(Viciaspp.)，大豆(Glycines max)，小扁豆(Lens sculenta)等（Winslow R D.Provisional lists of host plants of some root eelworm(Heterodera spp.).Annals of Applied Biology 1954,41:591-605），此外还可寄生野草寄主，寄主范围相对较窄。通常进行3-6年轮作就可降低豌豆孢囊线虫种群水平不对寄主构成危害，但必须严格控制野草寄主（Di Vito M,Greco N.The pea cyst nematode.In:Lamberti,F.& Taylor,C.E.(Eds).Cyst nematodes.New York & London,Plenum Press 1986,321-332）。被侵染的豌豆植株会矮化，叶片变黄，根部分支减少，不能开花或者花过早脱落，同受大豆孢囊线虫侵染的大豆一样，豌豆的根部发育不良。豌豆孢囊线虫完成一代大约需要3-15周，时间随着土壤温度的改变而变化。含有卵的孢囊即使在无寄主的条件下也能存活12年。豌豆孢囊线虫侵染后，豌豆开花期表现出矮缩黄萎，豌豆孢囊线虫抑制豌豆根瘤的形成和固氮作用，从而使豌豆产量降低，同时还可导致植株对土壤中一些对根部为害的菌类敏感，从而造成线虫与菌类的复合侵染。

目前豌豆孢囊线虫的鉴定大部分仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，豌豆孢囊线虫的孢囊与其近缘属种的孢囊形态类似，形态学鉴定耗时、需要很熟练的技术作为基础，并且需要专门从事分类的人员来完成，因此豌豆孢囊线虫传统的形态学鉴定方法不适用于大规模的样品检测且不能有效的调查豌豆孢囊线虫的分布和扩散。

为了弥补形态学鉴定的不足，快速、准确的对农作物孢囊线虫进行鉴定和检测，分子检测技术迅速发展。20世纪80年代后期发展成功的DNA多聚酶链式反应（PCR技术），使得直接扩增DNA成为可能，在PCR基础上还产生了各种新的分子标记技术，例如RFLP，RAPD,AFLP，Real-time PCR,SSR等。这些分子标记和检测技术都成功的应用到植物寄生线虫特别是农作物孢囊线虫的分类鉴定和检测过程中。

各种分子标记检测技术各有利弊，在这些分子标记中，RAPD标记（RandomAmplified Polymorphism DNA）的优点在于所需DNA量极少，要求设备也相对简单。在植物寄生线虫的分子检测中应用也越来越广泛。RAPD标记由Williams等和Welsh等两个研究小组在1990年发现。随着RAPD技术的应用，RAPD的缺点也凸显出来，由于RAPD引物非常短，只有十个碱基，退火温度也较低，如果PCR体系变化，或者仪器变化，重复性会变差，而且易产生非特异性的条带。为了弥补这一不足，Paran和Michelmore于1993年提出可以将其转为SCAR（sequence characterized amplified region）标记（Paran I,Michelmore R W.Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew risistence genes in lettuce.Theoretical and Applied Genetics 1993,85:985-993.），并应用到了快速分子检测中。