[发明专利]一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于筛选免疫反应灵敏基因领域，特别涉及一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法。

背景技术

甲壳动物缺乏特异性免疫，主要依靠非特异性免疫来识别和有效清除入侵的微生物和寄生虫等异物，它们的免疫系统主要包括细胞免疫和体液免疫，它们在免疫刺激下被激活。细胞免疫主要包括吞噬、节结的形成和包裹作用等。体液免疫主要是在外来物质的刺激诱导下合成分泌一些非特异性酶或因子等来抵御外来病菌的侵入。

拟穴青蟹属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，青蟹属(Scylla)，是我国沿海重要的海洋经济蟹类，具有较大的营养价值和商品价值。然而，近年来频繁发生的病害问题严重阻碍了我国青蟹养殖业的健康发展，在浙江、福建、广东等沿海主要青蟹养殖地区出现了持续病害。据水生动物病害测报资料，2006年全国青蟹平均发病率约13.77%，平均死亡率为51.43%，经济损失达2.29亿元，病害的爆发已经严重威胁到了青蟹养殖业的健康发展。已经报道的青蟹疾病有黄水病、褐斑病、白芒病、黄斑病、纤毛虫病、弧菌病、寄生性腰鞭毛虫血卵涡鞭虫病、嗜水气单胞菌病等（徐海圣等，2000；王荣智等，2008）。

面对青蟹养殖过程中日益严重的病害，养殖户迫于无奈只能使用抗生素，然而抗生素的滥用已经导致细菌产生了非常严重的耐药性，而且养殖蟹类病害爆发的病因也日趋多样性，这就迫切要求从蟹类自身的免疫防御入手，提高蟹类自身抗病力。蟹类的抗病力与其自身免疫相关功能基因的调控和表达有着密切的关系。因此，筛选和鉴别免疫相关功能基因对于蟹类天然抗病力的研究极为重要。

多重基因表达（GeXP）技术是一种全新的基因表达谱定量分析平台。GeXP技术能够在单一RT-PCR反应中检测多至25个基因的转录水平，是多重PCR领域的突破性技术，它巧妙的将多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，采用通用引物与特异引物相结合的方法，其起始RNA的用量可以低至10ng。GeXP技术是芯片和Q-PCR技术的换代产品，它把基因表达研究提升到一个更高的水平；这种技术可以监控的基因数目可以达到几十到几百个，可以处理的样本数可达数千个。基于RT-PCR的GeXP技术提供了一种敏感的、灵活的和可重复的基因定量表达分析技术。它不但可以处理大量的样本，而且一个反应中可以同时处理大于20个基因，而不像Q-PCR方法每次只能处理1个或几个基因。多重基因表达技术来筛选重要功能基因是个理想的技术手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，该方法工艺简单，成本低，能够从众多相关基因中迅速筛选到反应最为敏感的基因，具有良好的应用前景。

本发明的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，包括：

（1）将拟穴青蟹分成感染组和对照组，感染组注射100μL副溶血弧菌，对照组注射100μL生理盐水，同时处理24h，分别在第0h，1h，3h，6h，24h取样；抽取拟穴青蟹血液，采用Trizal法提取血细胞总RNA，-80℃下保存；

（2）以候选基因序列为靶序列，设计多重基因表达引物，以β-肌动蛋白作为内参基因，进行反转录反应和PCR反应，得到PCR产物；将PCR产物稀释后上样，测定候选基因的表达水平，即得到免疫刺激反应灵敏基因。

所述步骤（1）中的副溶血弧菌的浓度为2×10⁶CFU/mL，生理盐水的浓度为0.9wt%。

所述步骤（2）中的反转录反应的具体条件为：48℃1min，42℃60min，95℃5min。

所述步骤（2）中的PCR反应的具体条件为：95℃10min；94℃30s，55℃30s，70℃1min，35个循环。

多重基因表达引物序列见下表：

表1本发明用到的多重基因表达引物

上述候选基因序列见序列表SEQ ID No.19-26。

有益效果