[发明专利]同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及尿肌酐的检测方法，特别是一种同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法。

背景技术

尿肌酐是表征肾脏功能的重要生物标志物，对肾脏疾病临床研究（如急性肾衰竭早期诊断）意义重大。目前文献报道的尿肌酐分析方法包括：分光光度法、红外光谱法、表面增强拉曼光谱法、气相色谱质谱（GC-MS）法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱质谱（LC-MS）法、高效薄层色谱（HPTLC）法、毛细管电泳法、酶法等。在上述方法中，分光光度法是检测尿肌酐最经典和最常用的方法，但是该法易受到尿中内源物质干扰，方法选择性较差。以质谱为检测手段的GC-MS和LC-MS方法，与其它方法相比，具有选择性好、准确度高、响应灵敏等优点。然而LC-MS或GC-MS分析尿肌酐，因样品前处理和色谱环节耗时较长，无法满足肾脏疾病临床研究（如急性肾衰竭早期诊断）中高通量样品分析的迫切需求。

发明内容

本发明解决的目的就是提供一种具有快速、准确、抗基质干扰等特点，且技术分析周期短、效率高的同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法。

本发明的同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法，是借助电喷雾萃取电离（EESI）源和商品化线性离子阱质谱仪进行无样品前处理条件下尿肌酐的快速检测，具体步骤是：

（1）肌酐和氘代肌酐母液的配制：称取10.0 mg 肌酐和10.0 mg氘代肌酐固体标样，分别置入100mL容量瓶中，加入电阻率18.2 MΩ·cm的纯水溶解，分别制得浓度为100 mg L^–1的肌酐母液和氘代肌酐母液。

（2）肌酐标液的配制：移取肌酐母液，用水稀释为浓度100μg L^–1的肌酐标液，将标液转移至20mL棕色小瓶中，4℃密封避光保存。

（3）加标尿样的准备：取肌酐母液和氘代肌酐母液，分别用尿样逐级稀释，得到肌酐浓度为0.5-5 mg L^–1的加标尿样及氘代肌酐浓度为1 mg L^–1的加标尿样。

加标尿样是为EESI-MS定量分析尿肌酐时所用的标准加入法所备。配制加标尿样所用的尿样为高纯水稀释500–2000倍后的尿样，这是因为未经处理的原尿中的肌酐浓度高达几百甚至上千mg L^–1，为确保加标后尿肌酐浓度仍在定量曲线的线性范围内以及减少加标量，实际尿样须稀释后方可加标。

（4）电喷雾萃取电离源（EESI）参数的调试： EESI电离源为东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室制造的电喷雾萃取电离源（美国专利号：US 2008/0179511 A1），其搭建简便，已广泛使用。电喷雾电离（ESI）溶剂管路和样品溶液管路间的距离与角度分别约为1–2 mm和50–70^o，二者与质谱仪金属离子传输管入口的距离和角度分别为5–10 mm和145–155^o，初级ESI溶剂甲醇水混合溶剂，甲醇与水体积比大于5比1，流速1–5μL min^–1，样品溶液流速2–7μL min^–1，ESI电压+ 3-- + 4.5 kV，金属离子传输管温度375–450℃，样品雾化气为纯度99.999%氮气，压力0.6–1.4 MPa。

（5）二级串联质谱（MS/MS）参数的设置：正离子检测模式，质子化后的肌酐母离子m/z114或质子化后的氘代肌酐母离子m/z117；母离子隔离宽度2.0；活化值Q（AQ）为0.30–0.40，碰撞能量（NCE）为25–100%，碰撞时间 30 ms，质量数扫描范围15–200；离子阱最大离子注入时间 200 ms，实际注入离子量由自动获取控制（AGC）确定，碰撞气He气，离子阱内压力0.84–0.98 × 10–5 Torr。

 （6）样品检测：在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白，肌酐标液，未加标尿样，梯度浓度加标尿样；每次进样0.5 min，平行进样6次；测定MS/MS谱图中m/z 117、m/z 114、m/z 89和m/z 86处质谱峰强度，进行定性定量分析，m/z 86处质谱峰是肌酐分子离子（m/z 114）的二级质谱碎片离子，m/z 89处质谱峰是氘代肌酐分子离子（m/z 117）的二级质谱碎片离子。

（7）数据处理：包括定性分析（a）和定量分析（b）两部分：