[发明专利]一种牡蛎近缘物种鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及近缘种鉴定技术，具体的说是一种牡蛎近缘物种鉴定的方法。

背景技术

牡蛎属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)。牡蛎具有很高的经济价值，是世界各国重要的水产养殖对象，已成为中国乃至世界水产养殖产量最大的经济动物。尤其是牡蛎全基因组测序的完成，标志着牡蛎进入了基因组时代，牡蛎的分子生物学研究，功能基因学研究，组学研究等相关基础研究和应用性研究相继展开。物种的区分和鉴定是各种研究工作的基础，然而牡蛎物种种类十分复杂，外形极易受到环境的影响；关于其分类也存在诸多的争议和分歧，分类依据也不尽相同。近年来，随着分子生物学的发展，利用分子生物学手段来鉴定物种已经逐渐成为一种趋势，并为大多数的生物学家所接受。目前最常见的是应用线粒体COI基因及ITS序列差异作为区分不同物种的分类依据，但是这些基因序列之间的区别往往是SNP或者是In/de l，不同物种之间序列长度的变化并不明显，因此难以应用电泳等方法区别不同物种；测序可以取得这个基因或者序列的详细碱基信息，但是测序实验过程比较繁琐，花费也较高，并且需要大型仪器的支持，很难在短时间内实现准确、快速、简单的物种鉴定。

发明内容

本发明目的在于提供一种牡蛎近缘物种鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种牡蛎近缘物种鉴定的方法，以牡蛎基因组DNA为模板，根据牡蛎各物种基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)中的Tm值差异进而区分牡蛎物种。

通过上述扩增获得40bp-100bp的PCR产物，添加核酸饱和染料后95℃变性处理10分钟，冷却至室温进行HRM测定。

以待鉴定牡蛎基因组DNA为模板，根据牡蛎的COI基因序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线(HRM)中的Tm值差异进而区分贝类相近物种；序列扩增引物为：

COI-F1：TACTTAATATTGGGTTTTTAGGGT；

COI-R1：CGCGTATCAATATCCATTCC。

本发明所具有的优点：

1.方法简单易行；不需要测序，直接通过扩增片段的Tm值来反应DNA水平上的区别而区分不同物种。

2.结果明确直观；不用进行序列比对等步骤，不同物种之间DNA水平的差异以直观的峰图形式表现出来，极易区分辨别。

3.准确有效；本发明鉴定方法采用高分辨率熔解曲线(HRM)具有分辨单个核苷酸差异的能力，能够准确反映DNA水平上的差异，使得鉴定结果准确可靠，与测序结果相比较准确率为100％。

4.应用性广泛；与测序不同，不需要将待鉴定的所有个体一一测序分析。本发明中一组引物可以在无限多同类个体上进行物种鉴定而不需要重新设计引物。其次，本发明为一个开放体系，应用范围广泛；不仅可用于特定几种牡蛎近缘物种的鉴定，只要是基于DNA水平上的差异能够区分的牡蛎物种均可以利用该方法来鉴定。

附图说明

图1为本发明实施例提供的巨蛎属牡蛎近缘物种鉴定高分辨率熔解曲线图(其中横坐标为温度(℃)，纵坐标为荧光强度的对数值；每条曲线的最高点所对应的横坐标即为该曲线对应的PCR产物的Tm值)。

图2为本发明实施例提供的巨蛎属牡蛎近缘物种PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳检测图。

具体实施方式

本发明在依靠核酸序列区别而进行物种鉴定的过程中引入高分辨率熔解曲线方法，仅用一对PCR引物将不同物种在DNA水平上的差异转化成更直观的熔解曲线。其步骤为：

a.物种鉴定依据序列的获得：从已有数据库或其它来源获得能够区分目标物种的依据序列(如COI基因序列等生物标签序列)。

b.引物设计：比对不同物种之间依据序列的差异，寻找能够明显区分目标物种的区域，利用primer premier5软件在该区域内设计PCR扩增引物，使扩增产物在不同物种间应有明显序列差异(即Tm值不同)，主要体现为G、C含量不同。

c.PCR扩增：以待鉴定目标贝类的基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。

d.产物检测及处理：利用1％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物，确定扩增产物单一，无非特异性扩增后，每个反应添加1μl核酸饱和染料LC-green(Idaho，美国)，在普通PCR仪上运行95℃变性10min后冷却至室温。