[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒 RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：1×ThermoPol Reaction Buffer；BstDNA聚合酶；dNTPs；AMV逆转录酶；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl₂，DTT, 1000×SYBR Green I;

F3：5^，- CAGTGTGATCTCGACTTCCG - 3^，

B3：5^，- AGACCAACGCGTCAATCG -3^，

FIP：5^，- CGGTCGTCTGACGTACACCGTTTTTTGCCGGCATATGGGGTAA - 3^，

BIP：5^，- AGTTGGGTCAATTGGCTACGGTTTTTAGCACCATGGTACTGTTCG - 3^，。

2.一种用权利要求1所述的试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是：

1）、病毒RNA的获取:

采用TRIzol?或TRIzol?LS试剂或柱吸附洗脱法提取样本总RNA；

2）、RT-LAMP扩增:

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，DTT4mM，MgCl₂ 2-10mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer，选择55-65℃和30-120分钟进行RT-LAMP反应，80℃灭活2分钟；

3）、检测结果判定，采用下述三种方式之一：

A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；

B、每25μl体系的反应管加1000×SYBR Green I 1-2μl，1-5 min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性；

C、取扩增产物，用2%w/v的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

3.根据权利要求2所述的一种检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其特征在于：MgCl₂ 的浓度为8mM。

4.根据权利要求2所述的一种检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其特征在于：反应温度为63℃。

5.根据权利要求2所述的一种检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其特征在于：模板RNA在95℃5分钟后置于冰浴中进行预处理。