[发明专利]一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，提供一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法。

背景技术

单抗药物以其高特异性、有效性和安全性已经成为国际生物技术药物的支柱品种，占到了生物技术药物总额的36%，位居医药生物技术产品前列。2010年，单克隆抗体药物以480亿美元的销售额继续领跑全球药品市场，同比增长20%。2000-2010年十年间全球单克隆抗体药物市场复合增长率高达32%。整个抗体产品市场呈现爆炸式的增长方式，预计在未来十年内单克隆抗体药物将会成为全球生物医药领域发展的主导产品。单抗药物在肿瘤、自身免疫病、心血管及感染性等重大疾病的诊断治疗方面取得了突出的进展，目前FDA批准的治疗性抗体药物的主要靶点有：CD3、CD11、CD20、CD25、CD33、CD52、GpIIb/IIIa、呼吸道合胞体病毒F蛋白、人表皮生长因子受体-2（Her2）、肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）及表皮生长因子受体（EGFR）等。

1989年，Gospodarow从牛垂体滤泡细胞中分离纯化得到一种蛋白质，能特异作用于血管内皮细胞，引起血管内皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成，命名为血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），已证实VEGF是最重要的血管生成因子之一，是特异的内皮细胞促有丝分裂剂。VEGF分子量为46KD，PI≈8.5，对热、酸稳定，人类VEGF 基因定位于6号染色体短臂（6p21.3）上，全长14 kb，由8个外显子和7个内含子组成。因VEGF mRNA剪接方式不同，可产生5种异构体，分别编码121，145，165，189和206个氨基酸，其中VEGF165是主要的效应分子。VEGF是一种具有内皮细胞特异性的有丝分裂原，体外促进内皮细胞生长，体内诱导血管发生，促进血管生长。VEGF可以强烈地增加毛细血管后静脉和小静脉的通透性。Brock等报道，VEGF是已知的最强的血管渗透剂，高于组胺50000倍。目前认为，VEGF增加血管通透性与血管内皮细胞的渗透细胞器VVO（vascular vacuolar organelle）有关。

VEGF的过表达与肿瘤、渗出型年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)性黄斑水肿、骨髓增生异常性等疾病的发生密切相关，对VEGF单抗药物、反义核苷酸抑制剂、VEGF受体的药物研发成为当前医药领域的研究热点。

美国Genetech公司研制的血管表皮生长因子（VEGF）抗体，贝伐单抗（Bevacizumab，商品名Avastin），其通过抑制VEGF，使肿瘤组织无法获得所需的血液、氧和其他养分，以达到抗癌功效。2004年2月FDA批准上市用于治疗转移性结直肠癌和非小细胞肺癌NSCLC一线治疗的VEGF抑制剂，分子量为148 KD。继而Genetech公司开发和生产雷珠单抗（Ranibizumab，商品名Lucentis），其是针对脉络膜新生血管（choroidal noevascularization ，CNV）的VEGF抑制剂，是第二代人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体片段，由可降低免疫原性的非结合性人源化片段以及鼠高亲和力抗原决定簇两部分组成。Ranibizumab对人VEGF的所有亚型都具有特异性和亲和力，主要作用机制为结合VEGF165、VEGF121和VEGF110，阻止血管渗漏和新生血管的形成，从而抑制CNV的生成。2006年6月，FDA批准兰尼单抗用于治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD），2010年11月增加新的适应症—继发于视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)的黄斑水肿。Ranibizumab的分子量为48KD，动物实验表明，玻璃体内注射分子量较大的Bevacizumab不能穿透猴视网膜的内界膜，而注射Ranibizumab则可在1小时内完全渗透视网膜各层，并测得玻璃体内药物的半衰期为3.2天。