[发明专利]一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法

权利要求书

1. 大肠杆菌周质表达的抗VEGF抗体片段的纯化制备方法，其特征在于，包括

以下步骤：

（1）菌株构建和目标蛋白表达：构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析；构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，载体元件包括：大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、两个信号肽序列、两个终止子，分别转录和引导抗体的重链和轻链，引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割信号肽，重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子；载体转化大肠杆菌株Rosetta-gami 2（DE3）（黙克公司），筛选阳性菌株，摇瓶法小试筛选高表达菌株，对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段；

（2）周质提取：收集发酵菌液进行离心，将菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液，使用剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂，匀浆在1000bar压力下匀质3-5次，8500rpm，15min离心，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液；

（3）纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液进行热处理，此过程中出现大量宿主菌蛋白沉淀、絮凝，离心取上清即为初步纯化后的抗体片段；

（4） 纯化：使用阳离子交换—疏水介质两步法对表达的抗体进行纯化，SDS－PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度，蛋白纯度大于95％；

（5）超滤：使用Milipore超滤系统，将纯化后的蛋白进行脱盐、更换至抗体稳定的柠檬酸（10mM  pH5.0）缓冲液系统。

2.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，磷酸盐缓冲液pH为5.0-8.0。

3.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，溶解性增强试剂为二价阳离子试剂：氯化钙和硫酸镁。

4.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，溶解性增强试剂为硫酸镁。

5.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，硫酸镁浓度为10-120mM。

6.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，热处理温度为30°C-70°C，时间为30min-100min。

7.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，热处理温度为50°C-60°C，时间为30min-50min。

8.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，阳离子交换介质为Capto MMC。

9.根据权利要求1所述的重组VEGF抗体片段的纯化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，疏水层析介质为Phenyl Sepharose High Performance。