[发明专利]冠心病易感基因无创检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种冠心病的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估人群冠心病发生的风险级别，并且指导冠心病高危人群提早预防和治疗。

背景技术

冠状动脉性心脏病（coronary artery heart disease, CHD）已经成为严重危害人类生命健康的疾病之一。众多研究发现，该疾病具有较高的遗传倾向，通过分子诊断检测与冠心病发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患冠心病的风险，提早预防和治疗。

多数学者认为凡涉及到血栓形成、血管收缩、动脉粥样硬化的因素均易致CHD的发生。内皮型一氧化氮合酶（NOS3）是L-精氨酸和一氧化氮途径的关键酶。NO是所有硝基类扩血管药的活性成分，具有抑制血小板聚集、粘附，抑制白细胞的趋化激活，松弛血管平滑肌、舒张血管，抑制血管平滑肌细胞的增生、迁移及清除超氧自由基等重要作用。NO是心血管系统中抗冠状动脉粥样硬化、血栓形成，维持正常血管舒缩反应中必不可少的保护因子。生理状态下，血管内皮细胞能持续产生少量NO。NO产生量的减少或活性的下降均有可能参与CHD的发生与发展。因此，NOS3基因被列为CHD的一个侯选基因。有文章报道人类血浆NO代谢产物水平与NOS3基因多态性相关。近来的研究发现NOS3基因第7外显子中的G894T突变和CHD的发病及其心肌梗塞（MI）风险有关。2001年魏丹宏的研究表明，NOS3基因G894T突变与中国汉族人群CHD的发生有关，NOS3基因G894T 突变可能是中国人CHD的一个独立的危险因子。

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢系统中的关键酶，其基因多态性可导致叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，从而引发包括冠心病在内的多种疾病。2006年，潘棱等研究了122例冠心病患者与56例对照组的MTHFR C677T基因多态性。结果发现：冠心病组中TT、TC、CC的基因型频率分别为30%、45%、25%，T等位基因频率为53%,C等位基因频率为47%；而对照组中TT、TC、CC的基因型频率分别为25%、32%、43%，T等位基因频率为41%,C等位基因频率为59%。两组基因型分布和等位基因频率分布差异有显著性。从而得出结论：MTHFR基因C677T点突变与冠心病发病有一定的关系。

脂蛋白脂酶(LPL)基因多态性与血脂及冠心病关系密切,因此目前对脂蛋白脂酶基因多态性研究相对较多,但主要集中在Hind III酶切位点。该位点位于LPL基因的第8号内含子中，与8、9外显子分别相距600和700个碱基，是由一个T→G碱基置换引起Hind III酶切位点缺失导致的多态性，无Hind III酶切位点定为H-，有酶切位点定为H+，产生3种基因型H+H+、H+H-、H-H-。国内外研究表明，不同基因型与血脂成分及冠心病发病风险等级关系密切。

因此，建立简单、快速的冠心病易感基因无创检测方法，能够检测出与疾病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患冠心病的高危人群，有针对性的进行指导和预防，对于降低冠心病的发生、保障人群安全健康具有非常重要的意义。

发明内容

在基于G894T (rs1799983)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、LPL基因上HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估冠心病发病风险级别，本发明提供一种冠心病基因无创检测试剂盒。

该试剂盒包括：

检测G894T (rs1799983)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、LPL基因上HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；

PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O等）；

PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O等）；

DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等）。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul；

PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶 0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul；