[发明专利]一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，属于微生物领域。

背景技术

普洱茶(Pu-erh tea) 以云南的大叶茶(C. sinensis var. assamica)等大叶种茶的晒青毛茶 (普洱青茶，Pu-erh green tea)为原料，经过后发酵工艺生产而成的散茶和紧压茶。现代普洱茶生产工艺中渥堆发酵是生产普洱茶的关键工序，其生产过程中的微生物种类和数量直接影响普洱茶风味的形成，因此，微生物在普洱熟茶的渥堆发酵中起着重要的作用。然而，目前以形态学和生理生化指标为主要指标的检测和分类方法由于受到培养条件和模拟培养技术的限制，实际上所能检测到的微生物与实际上含有的微生物还有较大的差别。近些年，以DNA为主要指针研究环境中微生物的群落组成及基因功能能直接从分子水平对微生物进行研究。如何获得完整的、纯度高的普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA是对普洱茶中微生物分子生物学研究的基础。但是由于普洱茶茶叶本身含有很复杂的次生代谢产物，在渥堆过程中在微生物的作用下使普洱茶的成分转化分解的更为复杂，无机与有机化合物繁多，茶多酚、茶多糖、茶色素等交织混合，加之生产过程粗犷，金属离子等都存在其中，这些因素都严重的影响普洱茶微生物总DNA的高质量提取。因此，建立普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的提取工艺对研究其微生物分子生物学研究、普洱茶品质的提升及普洱茶生产工艺的改进都有重要意义。

目前对普洱茶微生物总DNA的提取的主要问题就是微生物以普洱茶茶叶为底物进行复杂的次生代谢，微生物表面甚至体内都粘附残存有大量的茶多酚、茶多糖、醌类等，使得提取较高质量的微生物总DNA非常困难。按照目前的方法提取出的普洱茶微生物总DNA，提取过程难以避免茶多酚、醌类等与DNA结合，提取出来的DNA杂质含量偏高，不能直接进行PCR扩增等后续分子生物学的研究；目前的方法还存在提取过程中细胞裂解率不充分，DNA与茶多酚、醌类等结合导致提取过程中损失过大等，导致提取率偏低。

发明内容

本发明的目的是提供了一种提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，该方法通过对普洱茶样品震荡洗涤，分离并洗涤微生物，减少茶多酚，醌类，金属等对DNA提取的影响，获得高纯度，大片段的微生物总DNA，提取出的DNA能直接用于PCR等后续分子生物学的研究。

本发明提供的普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的提取方法包括以下步骤：

（1）样品的预处理：取1-3g普洱茶渥堆发酵过程中的茶叶，剪碎至0.5-1cm，在茶叶中加入20-30mL洗涤缓冲液，静置20min后，超声波清洗仪中震荡处理10-15min，再涡旋震荡45-60s，取上清液；将上清液置于60-70℃水浴处理3-9min，低速离心后，取上清液高速离心收集菌体，在菌体中加入5-10mL洗涤缓冲液，混匀，再在60-70℃水浴处理3-9min，高速离心收集菌体；重复上述洗涤过程2-3次，直到菌体颜色接近白色，离心沉淀后上清液无颜色； 

（2）DNA的粗提：向步骤（1）中所收集到的菌体中加入液氮，使菌体在液氮的作用下结成块状，充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，继续研磨充分后，加入蛋白酶K，55℃水浴处理30min，60-70℃水浴处理45~60min；然后加入等体积的的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后10000g离心10min，回收水相，重复提取一次；在回收的水相中加入水相等体积的异丙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置30-45分钟，13000~15000g离心15~20分钟，沉淀用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入50~150μLddH₂O，即得粗提的DNA溶液；

（3）DNA的纯化：在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶，37℃水浴1-2h，用双蒸水稀释至500μL后，加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相并在其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分混匀，室温下10000g离心10min，回收水相，在回收的水相中加入2倍水相体积的无水乙醇和1/10水相体积的3M醋酸钠，混匀后-20℃放置20-30分钟，最后在13000~15000g下离心15~20分钟，取沉淀室温干燥后，加入50-150μLddH₂O，即得纯化后的DNA。