[发明专利]一种微生物转化制备(S)-(+)-1,3-丁二醇的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种微生物转化制备(S)-(+)-1,3-丁二醇的方法。

（二）背景技术

(S)-(+)-1,3-丁二醇((S)-(+)-1,3-Butanediol)，CAS登录号：24621-61-2，分子式C₄H₁₀O₂，分子量90.12。(S)-(+)-1,3-丁二醇是一种重要的手性药物中间体，以它为手性源可以合成大量的手性化合物。它是合成农业杀虫剂拟除虫菊酯的重要中间体氰醇的手性原料。拟除虫菊酯是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，其杀虫毒力比老一代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类提高10~100倍。拟除虫菊酯的化学结构较复杂，有旋光异构体或顺反式立体异构体，生产工艺的反应步骤较多，对原料质量和操作控制要求严格。除此之外，(S)-(+)-1,3-丁二醇可以被直接引入目标分子中合成天然产物；可以作为手性单体应用于路易斯酸介导的乙缩醛与亲核试剂的反应中；可以应用于光学活性的膦氧化物的合成；还可以作为生物活性物质作为糖尿病人的降糖药物。

1991年，Larcheveque M.等人采用L或D-苏氨酸经亚硝酸脱氨溴化、甲酯化、钯催化氢化以及氢化铝锂还原四步反应制得纯R或S-1,3-丁二醇对映异构体，总收率为64%。该过程反应步骤较多，收率不高。采用化学还原法不对称还原4-羟基-2-丁酮也可以制备(S)-(+)-1,3-丁二醇，但需要价格昂贵的化学催化剂雷尼镍做为手性催化剂，成本较高。2001年，Isidoro I.等人采用脂肪酶拆分外消旋体1,3-丁二醇制备了R或S-1,3-丁二醇，但是拆分效率最大只有50%，脂肪酶价格较为昂贵，因此脂肪酶拆分方法成本较高，生产效率较低。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种利用酿酒酵母生物转化4-羟基-2-丁酮合成(S)-(+)-1,3-丁二醇的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种微生物转化制备(S)-(+)-1,3-丁二醇的方法，所述方法包括：以4-羟基-2-丁酮为底物，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在pH 5.0~8.0的磷酸钾缓冲液中，于25~45℃下进行转化反应8~108小时，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(S)-(+)-1,3-丁二醇。

本发明所用菌株酿酒酵母CGMCC No.2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到，已在CN101230319A中披露，经发明人实验发现，该菌株具有良好的转化4-羟基-2-丁酮生产(S)-(+)-1,3-丁二醇的能力。该菌株菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。

底物4-羟基-2-丁酮在磷酸钾缓冲液中的初始终浓度为2~100mmol/L。

所述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1~50g/g底物。所述含酶菌体细胞可以是以游离细胞形式参加反应，也可以经固定化后以固定化细胞形式参与反应。固定化细胞可以包埋法制得，具体制备步骤可按照如下进行：将经酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1~5%（w/w）的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液中菌体浓度为3.0~10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5~4.0%（w/w）的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化颗粒悬浮液放置于35~38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒。将得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16~72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为本发明所用的生物催化剂。

所述的固定化细胞颗粒的直径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为1~5mm，最优选2mm。

在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1~5%（w/w），最优选2％。

本发明采用固定化细胞颗粒作为催化剂，将4-羟基-2-丁酮还原为(S)-(+)-1,3-丁二醇的生物转化机理如下：