[发明专利]一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产L-乳酸中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产L-乳酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

乳酸是一种古老且重要的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生产物，被广泛应用于药品、医药、饲料、化工的等领域。在食品工业上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。乳酸，尤其是L-乳酸具有很强的杀菌作用，可直接用作手术室、病房、实验室等场所的消毒剂。L-乳酸、L-乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。乳酸可添加至烟草中，能保持烟草的湿度，提高卷烟的质量。还可以用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽等。L-乳酸经聚合可生成立链的或环状的聚乳酸，在人体内能被分解成L-乳酸为人体代谢，因此可用于生产缓释胶囊制剂、生物降解纤维、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然条件下缓慢分解，它不像PVC、PP塑料那样造成“白色污染”。因此在制造食品包装材料和农用薄膜等方面有很大的潜力。由此可见，L-乳酸的发展前景十分诱人。

乳酸可以通过化学合成法、微生物发酵法（同型乳酸发酵、异型乳酸发酵）及酶法几种方法合成得到。由于微生物发酵能够专业得到L-乳酸且无污染，因此发酵法被广泛应用于L-乳酸的生产。目前国内外多以米根霉、德氏乳杆菌等进行L-乳酸发酵生产。根霉属于异型乳酸发酵，营养要求简单，但转化率相对较低，且发酵产物光学纯度不高。乳酸细菌属于同型乳酸发酵，转化率高，产物光学纯度也较高，属于化能异养型微生物，必须由外界提供多种营养物质及生长因子，如氨基酸、维生素、核酸碱基等。

自然界中产L-乳酸能力强，并可应用于工业生产的菌种只有霉菌中德根霉属及细菌中的乳杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属。为了提高发酵产L-乳酸的产量，降低生产制备成本，提高生产质量，国内外对其生产过程进行了大量研究，主要包括：生产菌种诱变改良、低价原料的开发利用、发酵工艺的优化等方面。由此可见，提高L-乳酸发酵产物光学纯度、提高发酵糖酸转化率、提高产物耐高糖能力等已经成为发酵产L-乳酸的研究热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种凝结芽孢杆菌及其诱变选育方法，使其发酵产物L-乳酸产量大幅度提高。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述凝结芽孢杆菌在混合发酵产L-乳酸中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC-N6242，已于2012年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012156。

本发明所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242的筛选方法是：凝结芽孢杆菌BC-3出发菌株经低能氮离子注入诱变后，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选得到耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株。然后将所得的菌株按一定比例与干酪乳杆菌LC-N235混合接入发酵培养基，经摇瓶发酵筛选出发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述过程，直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC-N6242。

本发明诱变得到的凝结芽孢杆菌BC-N6242菌株的形态学及生理生化学特征如下：

菌落颜色：米白色；

需氧方式：兼性厌氧；

菌落大小：2~6mm；

适宜生长温度：40~45℃；

适宜生长pH：7.0~7.4；

菌落形态：圆形；

革兰氏染色：阳性；

本发明所提供的凝结芽孢杆菌BC-N6242的诱变方法，具体步骤如下：

(a)、单孢子悬浮液制备：将凝结芽孢杆菌BC-3出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁶个/毫升。

(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20KeV、注入剂量为180×10¹³ions/cm²下对其进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上；在40~45℃下倒置培养2~3d。

(c)、琥珀酸平板初筛：将步骤(b)筛选到的能生长良好且透明圈大的菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在40~45℃下倒置培养2~3d，筛选菌株。