[发明专利]一种利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产碱性果胶酶的方法，尤其涉及一种通过对补料前后pH进行分段控制发酵生产碱性果胶酶的方法，属于生物酶制备技术领域。

背景技术

果胶酶（pectinases）是大一类可分解植物细胞壁组分果胶质的酶系总称，从分解方式上可以将果胶酶分为果胶水解酶和果胶裂解酶，前者主要包括原果胶酶（PPase）、果胶酯酶（PE）、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、聚半乳糖醛酸酶（PG）；后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL）和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（PMGL）。人们常称的碱性果胶酶一般指果胶裂解酶中的聚半乳糖醛酸裂解酶。果胶裂解酶通过反式消去作用裂解果胶聚合体，在C-4位置上断开糖苷键，同时在C-5处消去一个H原子。从而产生一个Δ4:5不饱和键。

目前对于果胶酶的研究已有大量的文献报道，其中研究时间较长的酸性果胶酶主要用于果胶组分的提取和果酒果汁的澄清，碱性果胶酶在制浆漂白，棉织物处理工艺中的应用取得了一定进展，特别是在麻类纤维的脱胶上的应用研究日趋增多。原麻是一种被各种胶质粘接在一起的片条状物，单纤维不易分开，因此在梳理纺纱之前必须对原麻进行脱胶处理。长期以来的脱胶方式主要是化学脱胶，其基本原理是利用原麻中纤维素和胶质成分对碱、无机酸和氧化剂的稳定性不同以去除原麻中的胶质成分。该方法往往导致麻纤维受损，影响麻织物的优良品质，同时消耗大量的化工原料和热能，造成严重的环境污染。因此该工艺不适应于经济社会的发展。近年来，生物脱胶受到了较多的关注，其主要包括微生物脱胶，酶脱胶和生物-化学联合脱胶。其中酶脱胶因具有操作灵活性强，便于添加脱胶助剂等优势而成为研究的重点。

日本学者Koki Horkoshi于1972年首次报道了嗜碱细菌可分泌碱性果胶酶，Junwei Cao，T.SaKai，Tohru Kobayashi等也相继分离筛选到产碱性果胶酶的菌株。我国从90年代初开始对碱性果胶酶进行了研究，已经报道的产生菌包括欧文氏菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、螺孢菌等，但研究工作主要停留在菌种筛选及对酶学性质的研究；在碱性果胶酶的发酵研究方面，大多停留在摇瓶条件优化，小型发酵罐产酶条件的初步优化研究上。刘曦等对高产碱性果胶酶枯草芽孢的产酶条件进行了优化，使酶活力提高到了14.82U mL^-1（碱性果胶酶高产菌株产酶条件的优化.生物技术,2008,18(6):71-74.）。蒋红菊等对多粘类芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶的培养基及发酵培养条件进行了优化，使酶活达到311UmL^-1（多粘类芽孢杆菌20185液态发酵产碱性果胶酶发酵条件的研究.中国酿造,2011,235:111-114.）。董云舟等在小型发酵罐中采用温度控制策略对碱性果胶酶进行发酵优化，使芽孢杆菌WSH03-09产碱性果胶酶的酶活达5.99U mL^-1（芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略.应用与环境生物学报,2005,11(3):359-362.）。刘慧娟等研究了不同温度(32-41°C)对芽孢杆菌WSHB04-02分批发酵生产碱性果胶酶动力学参数的影响，温度优化后可使碱性果胶酶的酶活达到53.0U mL^-1，生产强度为3315U(h·L)^-1（芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的温度控制策略.过程工程学报,2007,7(4):786-789.）。中国专利ZL 03131952.1公开了一株产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌，液体深层发酵得到碱性果胶酶酶活力为20UmL^-1；中国专利ZL 200410065807.X公开了一种通过氧气在发酵液中的传递速率体积溶氧系数（K_La）提高碱性果胶酶活力的方法，其酶活力达到了40U mL^-1，但该酶活力与工业化要求还有一段距离。李祖明等对克劳氏芽孢杆菌进行了紫外诱变育种和固态发酵条件优化（高产碱性果胶酶菌株的育种及其发酵条件的研究.工业微生物,2008,38(3):27-31.）；中国专利ZL 94105708.9、CN 101096650B、ZL 200410073818.2、CN 101235361A公开了不同菌株固体发酵生产碱性果胶酶的方法，由于酶活力测定方法不一，产酶能力无法直观比较；同时也因为固体发酵设备要求高、工艺复杂而鲜见其应用于工业生产。ZL 97109044公开了一株嗜碱芽孢杆菌及其苎麻脱胶的方法，但由于脱胶时间长（16-24h），果胶酶活力低也难于工业化应用。ZL01106844.2公开了一株碱性果胶酶生产菌CCTCC NO:M200038，并将发酵所得酶液应用于苎麻脱胶，由于其发酵酶活力较低而未能应用于工业化生产。因此通过发酵工艺控制和优化提高碱性果胶酶酶活力和容积生产效率，降低生产成本是技术开发和工程放大的关键。其中，pH控制优化在发酵生产中得到了广泛的应用，其可以有效调控细胞生长和产酶的理化环境，间接反映培养基的C/N和细胞存活情况，是发酵罐控制和优化的关键因素。由于发酵前期细胞生长和发酵中后期细胞大量产酶对于理化环境、营养状况要求存在差异，因此在pH的控制上也应当做出相应调整。在检索到的相关方法中，关于通过两段pH控制进行碱性果胶酶生产的方法还未见报道。