[发明专利]脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及处理脐带组织的方法，具体涉及脐带新鲜组织冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，特别涉及从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。

MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。

近期的研究显示，脐带组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。

但是，脐带组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份脐带组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将脐带组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，本领域需要一个简单和高效的脐带组织冻存、复苏和间充质干细胞的分离和扩增的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术冻存、复苏脐带组织方法的缺陷，提供一种简单有效的脐带组织冻存的方法，以及相配套使用的冻存脐带组织复苏的方法，以及复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法。本发明发现使用特定操作步骤的冻存、复苏以及分离和扩增，可以有效地获得间充质干细胞。本发明基于此发现而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了处理脐带组织的方法，该方法包括以下对脐带离体新鲜组织进行冻存的步骤：

(1)配制脐带组织冻存液：所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(二甲基亚砜)，配好的冷存液放在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏；

(2)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；

(3)脐带组织处理：将步骤(2)得到的脐带组织剪成组织块；

(4)脐带组织冷存：在0-15℃(例如1℃至7℃，例如4℃)的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存容器中，然后将冻存容器放入程序降温装置，先在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏0.2-2小时(例如0.5小时)，再在-10℃至-150℃(例如-80℃)的温度条件下冷冻0.25-3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的脐带离体新鲜组织进行复苏的步骤：

(5)冻存脐带组织复苏：将步骤(4)冷冻的脐带组织从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织，过滤去除废液，以使冻存的脐带组织复苏。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的脐带组织进行间充质干细胞分离和扩增的步骤：

(6)脐带组织贴壁处理：另取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块(例如10-15块)，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；