[发明专利]脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法

权利要求书

1.处理脐带组织的方法，该方法包括：

(A)以下对脐带离体新鲜组织进行冻存的步骤：

(1)配制脐带组织冻存液：所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(二甲基亚砜)，配好的冷存液放在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏；

(2)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；

(3)脐带组织处理：将步骤(2)得到的脐带组织剪成组织块；

(4)脐带组织冷存：在0-15℃(例如1℃至7℃，例如4℃)的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存容器中，然后将冻存容器放入程序降温装置，先在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏0.2-2小时(例如0.5小时)，再在-10℃至-150℃(例如-80℃)的温度条件下冷冻0.25-3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；

(B)以下对冻存的脐带离体新鲜组织进行复苏的步骤：

(5)冻存脐带组织复苏：将步骤(4)冷冻的脐带组织从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织，过滤去除废液，以使冻存的脐带组织复苏；

(C)以下对复苏的脐带组织进行间充质干细胞分离和扩增的步骤：

(6)脐带组织贴壁处理：另取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块(例如10-15块)，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；

(7)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO₂浓度为5%的37℃培养箱进行培养，培养至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞培养基；在第9-11天(例如第10天)时将平皿中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天(例如每2天)进行一次全换液；

(8)细胞传代：当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右时，使用消化酶(例如TrypLE Express，invitrogen产品)使贴壁细胞脱离平皿底部；离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；

以及任选的

(D)下列一个或多个步骤：

(9)针对步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

(10)将步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。

2.根据权利要求1的方法，其中所述脐带组织冻存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMSO。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，剪碎的组织是大小约0.2-2.5立方厘米。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织采用的是点滴法。

5.根据权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine、Gentamicin和DMEM-F12。

6.根据权利要求1的方法，其中：

所述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS；

所述间充质干细胞培养基中含有0.5-2%的L-Glutamine；

所述间充质干细胞培养基中含有0.02-0.1%的Gentamicin；和/或

所述间充质干细胞培养基中含有80-90%的DMEM-F12。

7.根据权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBS、约1重量份的L-Glutamine、约0.05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。