[发明专利]一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明提供了一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用，属于蛋白转导领域。 

背景技术

内皮抑素（Endostatin，ES）是1997年O′Reilly等首次发现的一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂。研究发现，ES可特异性抑制新生血管内皮细胞的生成，并对多种起源的新生血管内皮细胞生成有抑制作用，且不影响静止的血管内皮细胞，无耐药性，毒副作用小。我国已将血管内皮抑素衍生物研制成具有自主知识产权的国家一类新药Endostar(恩度，YH16)，用以治疗非小细胞肺癌。此外研究者们在ES防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。但是ES仍旧存在一些缺点，由于其体内半衰期短，入胞能力差，临床上的使用剂量较大，增加了患者的经济负担。如果能够通过一定的手段提高其稳定性、延长其体内半衰期、并增加其入胞能力达到提高其体内活性从而减少给药剂量或延长给药周期，将会大大提高ES的治疗效果，促进其在临床上的应用。 

能够穿透细胞膜的Tat蛋白可能帮助解决使药物透过眼球屏障进入作用部位问题。Tat蛋白来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子，1988年Maurice和Paul发现Tat蛋白能够跨膜递送入细胞，1997年Vives等证明Tat蛋白中有一段富含碱性氨基酸、带有正电荷的多肽片段（Tat蛋白中47-57位氨基酸序列片段）与其转导功能密切相关，并称之为Tat蛋白转导域（PTD），其序列是YGRKKRRQRRR。到目前为止研究表明，Tat PTD能够运载蛋白多肽、外源基因、脂质体、无机分子等多种物质有效进入细胞内。与其他运输载体相比，TatPTD具有其优越性：（1）转导效率不受连接物大小的限制，且对其运输的“货物分子”的活性不产生影响；（2）在一定范围内不会造成细胞损伤，不具有明显的免疫原性、抗原性和致炎性；（3）能穿透血脑屏障，有望解决大分子药物进入生物屏障结构发挥疗效的问题。此外，Tat PTD与大分子蛋白质相连以后，从结构上来看，也可以理解为对大分子蛋白质进行了一定的化学修饰，延长了肽链，有望增加蛋白质的稳定性，延长生物半衰期，也有利于提高其在治疗肿瘤等疾病的疗效。 

本发明利用穿膜肽Tat PTD的穿膜作用和内皮抑素的抑制新生血管的生成作用，将二者通过基因工程的手段融合在一起，以期获得能够穿透细胞膜甚至是血脑屏障或眼球屏障的内皮抑素，达到通过简单的局部滴眼给药预防眼部血管增生的目标。这一研究对探索大分子蛋 白质眼部给药的新途径和视网膜脉络膜病变的防治具有重要意义。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白，其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域（Tat PTD）的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人内皮抑素（Endostatin）的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

本发明还提供了能够表达Tat PTD-ES融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ ID NO.3(Tat PTD)和SEQ ID NO.4(Endostatin)所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。 

所述Tat PTD-Endostatin重组蛋白可以通过酵母或大肠杆菌体系表达，方法如下： 

采用酵母表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，步骤如下： 

（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的TatPTD-ES融合基因，并扩增； 

（2）用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ分别酶切质粒pGAPZαA和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接； 

（3）上述连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin；