[发明专利]一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种TatPTD-Endostatin重组蛋白，其特征在于：是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白，其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人内皮抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种表达Tat-ES融合蛋白的DNA序列，其特征在于：其具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。

3.一种采用酵母表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的Tat PTD-ES融合基因；

（2）用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ分别酶切质粒pGAPZαA和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接；

（3）上述连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin；

（4）制备感受态的酵母菌GS115，重组表达质粒pGAPZαA/Tat PTD-Endostatin单酶切线性化后经电转化法导入感受态的GS115菌中，在含Zeocin的LB平板上培养2-3天筛选转化子，挑选阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子；

（5）上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物，即为Tat PTD-Endostatin重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的酵母菌株为毕赤酵母或酿酒酵母。

5.一种采用大肠杆菌表达Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）常规方法制备含有编码Tat PTD的目的基因和编码Endostatin的目的基因的Tat-ES融合基因，并扩增；

（2）用限制性内切酶Nde Ⅰ、BamH Ⅰ分别酶切质粒pET28a和Tat PTD-ES融合基因，并分别回收酶切产物，然后用T4DNA连接酶连接；

（3）连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin，最终获得重组表达质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin；

（4）制备感受态的大肠杆菌Rossetta感受态细胞，将表达质粒热激法转化入Rossetta感受态细胞中，在含卡那霉素的LB平板上培养16h，筛选转化子，挑选阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子；

（5）上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物，即为Tat PTD-Endostatin重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）具体如下：

①挑选阳性转化子，过夜培养后，按1：100接入LB培养基中，震荡培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，加入IPTG，37℃，200r/min，诱导6h，收菌；

②将菌体破壁，采用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定；

③包涵体复性：菌体超声后离心得包涵体，采用稀释复性或透析复性或超滤复性法对包涵体进行复性；

④分离纯化Tat PTD-Endostatin融合蛋白：将复性成功的蛋白质经亲和层析或离子交换层析进行纯化，除盐后得目的蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述③中复性的具体方法如下：菌体破壁后，10000g离心30min，弃去上清得到包涵体；采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次去除粘附的杂蛋白；采用变性液对包涵体进行溶解，在室温搅拌2h后，10000g离心30min，上清为包涵体溶液；然后，将包涵体溶解的、变性的无生物活性的蛋白质复性，使其能够折叠形成可溶的、有生物活性的构象。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述④中，采用G25-Sephadex、超滤或透析的方法除盐。