[发明专利]力墀永肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用、制备方法

说明书

第一部分：技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种基因工程多肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用和制备方法。

第二部分：背景技术

天然抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，通常是由20～60个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右，多数具有2～4个二硫键，并含有α螺旋或β折叠结构。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，少数抗菌肽具有抗病毒或抗肿瘤的作用。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。力墀永肽是采用基因重组，工程菌表达得到的，具有抗肿瘤作用的一种抗菌肽。

从生物界分离到的抗菌肽可达750多种，它们分布极其广泛，从病毒、细菌、植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物均有发现，不同来源的抗菌肽的作用范围目前尚未有系统和深入的研究。近10年来，随着动物及微生物抗菌肽理论与应用研究的逐渐深入，发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，抗菌对正常哺乳动物细胞及昆虫细胞无不良影响，但对癌细胞则有明显杀伤作用。

植物源的抗菌肽在分离纯化、抗菌特性、细胞毒性、理化性质以及转基因等许多方面的研究进展也很快，发现了一大批理化性质和抗菌特性各异的植物抗菌肽。部分植物源的抗菌肽对G⁺菌、G^-菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒杀作用，尤其对植物病原具有良好活性，人们对于植物源的抗菌肽在药物方面的应用寄予了深厚的期望和好奇，特别是在人类疾病，如癌症的治疗上。比如源自槲寄生的槲寄生毒素(VtB)，氨基酸序列如Seq ID No.3所示，包括3个二硫键，其含有α螺旋和β折叠结构，具有抗肿瘤的作用。

由于抗菌肽分子小，天然资源有限，分离提纯存在一定的困难，足量的天然抗菌肽很难得到；抗菌肽的活性取决于多肽的空间结构，而化学合成的多肽的空间结构存在不确定性，所以不能得到具有活性的产品；基因工程菌是最有希望经济、足量获得活性多肽的良好途径，但是据报道高浓度的抗菌肽可杀灭绝大多数宿主细胞，同时在分泌表达过程中，抗菌肽容易被宿主菌的酶系统所降解，从而产生两败俱伤的情形，而无法真正获得足量的表达产物。目前还没有该类多肽的产业化生产技术报道，也未见到准确表达和获得足量的该类多肽以供试验用的报道，更未见到其在癌症治疗方面的应用报道。

第三部分发明内容

本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种源自槲寄生毒素VtB的变构肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用与制备方法。

力墀永肽，其特征在于具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列。

编码上述力墀永肽的基因。

所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

含有上述基因的表达载体。

所述表达载体的骨架载体为pKLAC1。

上述力墀永肽的制备方法，其特征在于将上述表达载体转入到酵母感受态细胞中，发酵培养。

所述酵母感受态细胞为K.lactis YCT799。

上述力墀永肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

所述药物为液态注射剂。

本发明根据源自槲寄生的抗菌肽VtB，对其氨基酸序列Seq ID No.3进行变构，在其N端增加一个甘氨酸G，第19位和20位氨基酸残基甘氨酸GG变为半胱氨酸CC，去掉第23位精氨酸R，24位甘氨酸G，26位半胱氨酸C和27位丙氨酸A的氨基酸残基，将第28位氨基酸残基丝氨酸S改为苏氨酸T，得到如Seq ID No.1所示的多肽，命名为力墀永肽，由43个氨基酸组成，分子量为4543.3Da，等电点9.01，疏水比率30％，净电荷+5。含有几丁质结构域与类凝聚素结构域。通过变构，改变了多肽的二硫键位置和空间构象，使得分泌表达出的多肽非常稳定，不会在发酵、纯化和保存过程中被迅速降解，以保证得到高表达量的产物。通过变构，增加了该多肽在动物体内的半衰期，可取得更有效的活性效果。本发明从氨基酸序列及易制造性和稳定性上改变了槲寄生毒素VtB。试验证明，本发明采用基因工程发酵培养方法制备的力墀永肽的产率达到1克/升；体内药物试验小鼠肉瘤S180表明，静注20mg/kg力墀永肽对小鼠黑色素瘤的抑制率可达61.48％。

本发明根据上述Seq ID No.1所示的氨基酸序列，设计了编码该氨基酸序列的基因序列，利用密码子的兼并性，调整了核苷酸序列使其符合酵母表达系统对密码子的偏好性而得到Seq ID No.2所示的核苷酸序列，有利于稳定高效表达抗菌肽。