[发明专利]重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组二聚化抗凝血酶III的Fc融合蛋白及其制备方法和它在医疗上的应用，特别是在治疗多种凝血相关的疾病，抗血管新生，抗炎症和抗病毒方面的用途。

背景技术

人体内与凝血系统功能相拮抗的是抗凝血系统，在正常情况下，两者保持动态平衡。抗凝血酶III(AT)是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子，它在血浆中承担着70％的生理性抗凝血酶活性(Johnson DJ等，EMBO J，2006，25：2029-37)，在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起非常重要的作用。AT是肝细胞和血管内皮细胞分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Serine Protease Inhibitor，SEPIN)的重要成员之一。AT通过与凝血酶FIIa结合成凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物，从而灭活凝血酶。此外，它还可以较强地抑制凝血因子Xa、IXa的活性，对凝血因子XIa、XIIa、纤溶酶、激肽释放酶的活性也有一定的抑制作用。

体内AT升高一般不会引起病理性后果，但是AT量减少常见于以下病例：a)遗传性AT缺乏：遗传性抗凝血酶缺陷症是一种较常见的人类遗传性疾病，它与家族性静脉血栓形成倾向有关(Abildgaard U等，Thromb Haemost，2007，98：97-104)；b)获得性AT缺乏：见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等；c)AT丢失增多：如肾脏疾病；d)AT消耗增多：如各种原因所造成的血液凝固性增高，AT中和活化的凝血因子，以致消耗增加；e)最重要的是：AT的先天性或后天获得性缺乏症可导致血栓的形成，而引起脑血栓或心肌梗塞等非常严重的疾病。因此，AT在临床上有预防和治疗慢性血栓或血塞形成的作用，对治疗抗凝血酶缺失症也有显著效果。

除了抗凝作用，AT还具有抗炎作用。其抗炎作用首先由Taylor在猴子模型上研究弥散性血管内凝血(DIC)时提出，他发现输注AT能大大降低接受致死量大肠杆菌猴子的死亡率(Taylor FB Jr等，Crit Care Med，2000，28：S12-9)。越来越多的证据表明体内凝血与炎症反应之间存在网络效应关系(Esmon CT，Blood，2000，95：1113-16；Cirino G等，Thrends Pharmacol Sci，2000，21：170-2)。Johnson等(Johnson K等，J Immunol，1998，160：5130-35)进一步研究发现，身体内局部血栓的形成可刺激单核细胞及血管内皮细胞合成大量的促炎因子，包括IL-8、IL-6。凝血酶在其中也起重要作用。凝血酶能裂解白细胞、内皮细胞源性的IL-8(含77个氨基酸，第77位残基为丙氨酸残基)生成含72个氨基酸的IL-8(第72位的残基为丝氨酸)，增强了其中性粒细胞激活活性，故当凝血酶及IL-8在血管炎症反应部位共存时可放大IL-8的效应。相应的，严重炎症反应还可通过白细胞-内皮细胞的相互作用损伤微血管细胞、微血管组织，进而刺激凝血酶的大量生成。迄今AT抗炎作用机制尚未完全阐明，可能存在多种作用机制。Okajima等(Okajima K等，Semin Thromb Hemost，1998，24：27-32)认为AT可促使内皮细胞释放PGI2，PGI2能抑制白细胞-内皮细胞相互反应；同时，AT还通过与内皮细胞表面的葡胺聚糖相互作用，干扰了细菌毒素与葡胺聚糖的结合，减轻了细菌毒素的细胞反应，所以AT的抗炎作用与其与内皮细胞上的葡萄糖胺聚糖结合能力紧密相关(Johnson DJ等，EMBO J，2006，25：2029-37)。Minnema等(Minnema MC等，Blood，2000，95：1117-23)认为AT通过抑制凝血酶/FXa介导的促炎因子如IL-6、IL-8、IL-10等的释放来削弱炎症反应。另外AT灭活了丝氨酸蛋白酶活性中心，从而抑制丝氨酸蛋白酶本身引起的细胞炎症反应。大量的研究表明AT在多种组织中发挥其抗炎功能。在肺组织中，AT可抑制嗜中性粒细胞的渗透作用，且减少微血管渗漏(Duru S等，Acta Anaesthesiol Scand，2005，49：1142-8)。在肝组织中，AT通过调节局部前列环素水平来抑制肝损伤(Aytekin FO等，Am J  Surg，2005，189：161-6；Tsuboi H等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292：G678-83)。在胃肠道，AT可减少白细胞在血管内的粘附和集聚(Ostrovsky L等，Circulation，1997，96：2302-10)。在皮肤组织中，AT可降低脂多糖(LPS)诱导的白细胞-内皮细胞间相互作用(Hoffmann JN等，Am J Physiol Cell Physiol，2000，279：C98-107)。此外，AT还被发现对非典型性分枝杆菌感染(Chan ED等，Scand J Infect Dis，2007，39：690-6)、糖尿病(Hashemi M等，Diabetes Res Clin Pract，2007，75：246-8)和脂膜炎的病理过程有影响作用(O’Riordan K等，Transplantation，1997，63：480-2)。进一步的实验发现AT的抗炎特性与其使用剂量有关。小剂量的AT(50U/kg及100U/kg)虽能明显抑制内毒素诱导的大鼠发生凝血障碍，但不能阻止白细胞在肺内的聚集及对肺血管造成的损伤。而大剂量的AT(250U/kg)能显著改善由内毒素诱导的肺内皮细胞的损伤(Uchiba M等，Thromb Res，1998，89：233-41)。这一研究结果也已在AT对重症感染疾病治疗作用研究的多中心KyberSept III期临床试验中得到证实。