[发明专利]TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体。

背景技术

TRPC6（瞬时受体电位阳离子通道6）蛋白是重要的足细胞膜蛋白之一，其基因突变产物可导致大量蛋白尿，从而引起局灶节段性肾小球硬化（FSGS）和进行性肾衰竭。有研究发现在人类非遗传性蛋白尿性肾脏疾病如FSGS、微小病变性肾病和膜性肾病患者中，TRPC6表达显著增加，并且成群分布，有节段性密集型。FSGS是一种常见的肾小球疾病，人群发生率约为百万分之二，其临床特征为大量蛋白尿、肾病综合征和进行性肾功能不全。FSGS约占激素耐药性肾病综合征儿童的7~15%，占成人激素耐药性肾病综合征的15~20%。

FSGS是一种病理学诊断，其依据是光学显微镜下所描述的一种仅累及部分肾小球(局灶)的部分节段性血管袢的瘢痕形成模式(硬化)。该硬化可发生于多种情况，仅以光学显微镜下病理形态学特征命名的FSGS在临床诊断治疗方面均表现出极大的异质性。由于免疫病理检查可能因穿刺时未取到局灶性的硬化肾小球，或因病理切片制作数目过少而未观察到节段性的硬化病灶，从而会导致FSGS的漏诊。

目前用于检测TRPC6的均为多克隆抗体，在应用中非特异性结合因素多，难于评价和分析结果，而TRPC6单克隆抗体的制备可以克服这些局限性。此外，有关各组织TRPC6表达的测定多以mRNA检测为主，没有在蛋白水平上分析，利用TRPC6单克隆抗体构建体外免疫学技术方法，测定蛋白水平的表达，更有利于疾病的分析与病情愈后监测。

抗人TRPC6多肽单克隆抗体制备是采用淋巴细胞杂交瘤技术，该技术的基础是细胞融合。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合后，可形成能分泌针对单一抗原表位的均质的高特异性的抗体，即单克隆抗体。由于骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞不能在体外增殖，因此将两种细胞融合后既具有肿瘤细胞无限增殖特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外增殖的缺点，融合的细胞被称为淋巴细胞杂交瘤。

为了能建立简便乙型的检测方法对FSGS进行诊断，首先需要筛选合适的TRPC6多肽序列，获得良好的免疫原，但目前并没有免疫原性好且特异性高的抗原多肽。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种TRPC6抗原多肽。

本发明的另一目的是提供一株能分泌抗上述TRPC6抗原多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的又一目的是提供上述TRPC6抗原多肽的单克隆抗体。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

为了能建立简便易行的检测方法对FSGS进行诊断，首先筛选合适的TRPC6多肽序列，获得良好的免疫原，便可以制备抗TRPC6的单克隆抗体。基于单克隆抗体的优势可用于免疫学方法的构建，可特异性的用于FSGS过程中TRPC6蛋白表达的测定。具体技术方案如下：

一种TRPC6抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。TRPC6蛋白共有931个氨基酸，经过对其进行穿膜区域、保守区域等多方面的研究，最终筛选确定15个氨基酸序列即KDLTKVTLGDNVKYY，作为抗原多肽，既避开了穿膜结构，又具有高度的保守性（在人、大鼠和小鼠中均有）。

一株杂交瘤细胞株H8，是由上述TRPC6抗原多肽作为抗原制备得到，能够分泌抗TRPC6的单克隆抗体，于2012年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC-C201236。

一种抗TRPC6的单克隆抗体，是由上述杂交瘤细胞株分泌得到的。

该抗TRPC6的单克隆抗体的制备方法如下：

（1）TRPC6抗原多肽合成，与KLH（keyhole limpet hemocyanin，血蓝蛋白）欧联后免疫小鼠；

（2）杂交瘤细胞株制备与筛选：取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养，然后用常规间接ELISA检测技术筛选，建立杂交瘤细胞株；

（3）单抗的纯化及鉴定：对所得杂交瘤细胞株分泌的单抗进行纯化，可以采用辛酸-硫酸铵沉淀法或离子交换层析法纯化，SDS-PAGE电泳分析纯化结果，经鉴定最终得到抗TRPC6的单克隆抗体。

上述抗TRPC6的单克隆抗体可作为体外免疫诊断试剂用于检测与TRPC6分子表达相关疾病，如局灶性节段性肾小球硬化等。也可以用于TRPC6蛋白过表达的组织及疾病监测，或经改造人源化后与药物偶联进行免疫靶向治疗。