[发明专利]一种以电化学生物传感器实时检测酶中间体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测酶中间体的方法。具体涉及采用电化学生物传感器对酶-底物复合中间体的相对量，以及它们随底物浓度和抑制剂浓度的变化进行实时测量。

背景技术

酶活性检测是生物化学的基本技能，也是医学诊断、药物设计、食品工程、环境监测等领域的基础。传统的检测方法有液相色谱法、茚三酮显色法、Nessler定氨法等，这些检测是一种终态的测量，不能对反应进行中物质的变化进行连续跟踪。紫外光谱、动力学分析等方法虽然可以进行连续跟踪，而监测的对象要么是底物的消耗，要么是产物的累积，但难以对反应的中间体进行测定。

酶-底物复合中间体是酶动力学和酶机理研究最为直接的对象。然而，由于它们是瞬间存在的不稳定物质，所以对其进行观测和定量分析是十分困难的。传统的研究方法有终点法和连续法两种方式。终点法是在催化体系中加入化学淬灭剂以终止反应，然后用荧光光谱(Huang H，et al.，Analyst 2012，137，1481-1486)、质谱(Houston CT，et al.，Anal.Chem.2000，72，3311-3319)或色谱(Guasch A，et al.，J.Chromatogr.1989，473，281-286)进行测量。连续的方式是利用停流法或T-跃迁法进行实验，并用紫外光谱仪(Rowe GT，et al.，Inorg.Chem.2007，46，10594-10606)或荧光光谱仪(Gong P，et al.，Anal.Biochem.2009，391，45-55)进行检测。

酶生物传感器有着多方面的应用。例如，对糖尿病人的血糖监测(Han M，etal.，Biosens.Bioelectron.2012，31，151-156)。此类传感器是基于氧化还原反应中所产生的微电流与底物浓度之间存在着的线性关系，并以此从电流值来推算底物的浓度。传感器方法非常灵敏，能够侦测出纳米级浓度的底物。其实，与传感器电流直接存在着计量关系的并不是底物的浓度，而是反应中间体的生成或消耗速率。例如，消耗一个过氧化物酶-H₂O₂复合氧化中间体I和一个过氧化物酶-H₂O₂复合氧化中间体II各需要两个电子，共有4个电子进行传递[George P.Nature 1952，169，612-613]。因此电流与中间体的数量成正比。

目前，生物传感器已发展到第三代，即无电子媒介体的生物传感器，但此类传感器的应用尚不成熟。而电子媒介体的使用并不影响对酶活性的测量。因此，以辣根过氧化物酶和氢醌电子媒介体为代表的第二代生物传感器可作为酶活性测定较为理想的装置。

与以往生物传感器的使用目的不同，在这里传感器并不是用来检测底物浓度，而是用于对瞬间存在的酶中间体的相对量进行持续的测量，并且由此来分析底物和抑制剂对酶催化反应所产生的影响。此方法可进一步为酶动力学和酶机理的研究提供一种灵敏的和实时在线式的实验手段。

发明内容

本发明的目的之一是建立一种能够实时测量反应中间体相对量的方法。

本发明的目的之二是建立一种能够对固定酶活性和抑制进行检测的方法。

本发明的目的之三是进一步为酶动力学、抑制动力学和酶机理研究提供一种新的实验手段。

为了达到上述目的，本发明将辣根过氧化物酶(HRP)传感器引入到酶催化活性的检测中。在催化反应体系中，H₂O₂被HRP的还原成H₂O，而HRP则被氧化成HRP氧化中间体I。HRP氧化中间体I能被对苯二酚(氢醌)还原成HRP氧化中间体II，随后再消耗一个氢醌分子进一步还原成初始的HRP。同时，2个分子的氢醌也被氧化成苯醌。每个苯醌分子在负电极上各得到2个电子重新还原为氢醌，那么电极共失去了4个电子来维持催化反应的一次循环。于是，在电极上可以检测到微电流。由于还原酶中间体I和II会在电极上转移4个电子。因此，反应体系内酶中间体的还原速率就与电极上电子传递的速率(电流)成正比。如果中间体的寿命恒定不变，那么中间体的消耗速率则又与中间体的存在量(浓度)成正比。由此推知，检测电流反映了中间体的存在量。即使不能确定绝对浓度，也可以电流的变化来反映酶中间体相对量的变化。

具体工艺如下：

电化学传感器采用酶传感器三电极系统：将玻碳电极作为工作电极，铂丝作为对电极，甘汞电极(SCE)作为参比电极。

将多壁碳纳米管沉积在玻碳电极表面上。