[发明专利]用于检测和测定甘草酸的抗体、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及甘草酸及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。

背景技术

本发明涉及用于检测和定量甘草酸的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、包被原和抗体。

其中“检测”是指定性分析物质是否存在。

其中“测定”是指对物质进行定量分析。

甘草酸(GA)是一种萜类物质，分子式C₄₂H₆₂O₁₆。又称甘草甜素。为甘草次酸的二葡萄糖醛苷(见苷)，是甘草的甜味成分，存在于甘草属植物中，在乙酸中结成片状或棱柱状晶体。在220℃分解。溶于水。

现代药理学研究表明其具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增强免疫功能等作用。由于甘草酸有糖皮质激素样药理作用而无严重不良反应，临床被广泛用于治疗各种急慢性肝炎、支气管炎和艾滋病，还具有抗癌防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能。

另外，甘草酸具有降血脂与抗动脉粥样硬化作用，阻止动脉粥样硬化的形成。甘草酸化学结构如下：

目前建立了多种甘草酸的定性与定量检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含甘草酸的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时甘草酸可能呈结合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的甘草酸游离后才能测定；同时还需要浓缩以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；同时由于甘草酸进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。另外，对于甘草酸在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和westblot等方法，但由于缺乏甘草酸的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中甘草酸的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。

发明内容

本发明的半抗原甘草酸可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本发明提供一种如下结构的免疫原：

其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R＝0，即P1直接与绿原羰基碳原子结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基，更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。

P是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BAS)。合成多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

半抗原的制备  本发明描述了用改进后的过碘酸氧化法将半抗原甘草酸与赋予抗原性的载体物质发生的偶联作用，产生免疫原。以甘草酸为起始原料，用过碘酸将甘草酸上糖基的邻二羟基氧化为醛基。产物纯化经质谱(MS)和核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)确证。

免疫原的合成  本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域已知的任何连接方式。例如但不限于过碘酸氧化法、碳二亚胺法(EDC)、戊二醛法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，将与过碘酸反应后的溶液PH调节到9.0至9.5之间，在室温下逐滴加入10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1-6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

合成免疫原的分析方法为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用紫外分光度法或矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对每个免疫原进行评估。甘草酸免疫原反应物和产物的吸收峰相比(200nm-400nm)，可判断是否偶合，并根据反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。