[发明专利]通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

流感病毒根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成，根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型。

甲型流感病毒为常见流感病毒，易变异，最具攻击力，可引起人的流感并有时引起肺炎和其他并发症，主要是气管和支气管纤毛柱状上皮细胞的坏死和脱落，有些病毒株能自然感染禽类和哺乳类动物，具有暴发突然、蔓延迅速、流行广泛的特点。世界范围的流感大流行共发生4次，其中1918-1919年世界流感大流行导致2000万人死亡。中国近半个世纪以来流感流行共计发生18次，其中3次为大流行。

目前，常用的甲型流感病毒实验室检查方法包括：1)免疫学检测方法，如快速流感抗原检测、免疫荧光法(或装配的IFA)，此法灵敏度较低，不易推广应用；2)细胞生物学检测方法，常用有鸡胚接种法和细胞培养法，此法对病毒分离法较敏感，但需要2-3周时间，无法实现早期快速诊断；3)分子生物学检测方法，目前有逆转录酶-聚合酶链式反应(Reverse Transcriptase-PCR，简称RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time Fluorescent Quantified PCR，简称FQ-PCR)，RT-PCR采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式，易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，实时荧光定量PCR(FQ-PCR)虽在技术上解决了上述问题，其灵敏度和准确度较高，但操作复杂，检测成本相对昂贵，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

为解决现有的通用型甲型流感病毒(IAV)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝的IAV扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶标核酸(IAV RNA)序列特异结合，在有IAV内标(IAV IC RNA)时，其最好还可与该IAV内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV检测探针存在于一IAV检测液中。