[发明专利]能够同时检测CymMV和ORSV的RT-PCR检测试剂盒及方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种能够同时检测建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。

（二）背景技术

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是侵染兰花最常见的两种病毒之一。CymMV隶属线形病毒科（Flexiviridae）、马铃薯X病毒属（Potexvirus），CymMV病毒粒子为线状正链单链RNA（+ssRNA），大小约为475nm×13nm或为490nm×13nm，病毒外壳无包膜，线行弯曲，螺旋对称延伸，螺纹明显，螺距2.8nm，5’端有甲基化结构，3’端带有poly(A)尾巴，病毒RNA基因组全序列约6-7kb，整个基因组由5个开放读码框架（ORF）构成，编码为RDRP（160KDa）、TGB（26KDa/13KDa/10KDa）以及CP(24KDa)，其中CP基因是完整地ORF5框，长约700nt，编码24kD的外壳蛋白，与该同属的其它成员有很高的同源性。

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）也是侵染兰花最常见的两种病毒之一，曾经被命名为烟草花叶病毒兰花株系，ORSV隶属烟草花叶病毒属（Tobamovirus），ORSV病毒粒子形状为立体杆状，大小为300nm×18nm，螺距对称，螺纹明显，ORSV病毒粒体由衣壳蛋白和+ssRNA组成，衣壳蛋白无包膜，单组分或多组分，5’端含有甲基化帽子结构m7G5’PPP5，3’端带有类似t-RNA的结构。病毒RNA基因组全序列约6-7kb，是烟草花叶病毒属中最长的，包含4个ORF，基因组RNA编码181KDa的通读蛋白分别含126kDa RdRp蛋白、34kDa运动蛋白、52kDa推断复制酶蛋白和18kDa外壳蛋白。CP基因位于最后一个ORF，长约470bp，编码18kD的外壳蛋白，与该同属的其它成员也有很高的同源性。兰科植物受CymMV和ORSV病毒病严重侵害而无法根治的问题，其中复合侵染率高，一旦感染了这两种病毒，兰花的叶片将会形成褪绿条纹、凹陷的灰白斑或者是坏死圈斑等症状，导致植株生长不良、开花小而少、花期缩短、使植株的观赏价值大为下降，造成巨大经济损失，是阻碍兰科植物正常生长、兰科珍惜种质资源保存及兰花产业发展的重要瓶颈。常规的病毒血清学检测方法普遍存在灵敏度不高的缺点，而一般的分子检测病毒，RNA提取质量的好坏对实验结果影响很大，而RNA又特别容易降解，提取技术要求高；同时，要检测两种兰花病毒必须要设计针对两种病毒的不同引物对，检测的过程也要分开进行，费时费力。

（三）发明内容

本发明目的是提供一步RT-PCR同时检测CymMV和ORSV两种主要的兰花病毒的试剂盒及方法。

本发明采用的技术方案是：

一种能够同时检测CymMV和ORSV的RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性简并引物以及PCR反应试剂，所述简并引物核苷酸序列如下：

上游引物：5’-TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’；

下游引物：5’-TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’；

其中Y、M、K、W、R为简并碱基，Y为C或T，M为A或C，K为G或T，W为A或T，R为A或G。

简并引物是获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。本申请发明人利用NCBI上的CymMV与ORSV病毒核酸信息，通过DNAMAN软件对两种兰花病毒进行同源比对（Ktuple=6,Gap_penalty=7），设计了同时针对两种病毒的一对简并引物，引物序列及结合位点见图1。预期扩增目的条带大小分别为：CymMV 558bp；ORSV 825bp。

本发明的关键在于简并引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物混合，再加入待测样品，即可进行PCR扩增反应。

本发明还涉及一种一步RT-PCR检测CymMV和ORSV的方法，所述方法包括：