[发明专利]检测绵羊无浆体的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测动物血液病原菌的试剂盒。确切讲本发明涉及一种用于检测绵羊无浆体的试剂盒。

背景技术

绵羊无浆体(Anaplasma ovis)是立克次体目(Rickettsiales)、无浆体科(Anaplasmataceac)中的无浆体属(Anaplasma)的一个重要成员，Schellase等人于1912年首先报道在东非发现了绵羊无浆体，绵羊无浆体有广泛的宿主，已经证明它能寄生于绵羊、山羊、马鹿、白尾鹿、羚羊和大角羊等反刍动物的体内，绵羊无浆体经节肢动物-蜱传播后寄生于宿主动物的红细胞内，引起以发热、贫血、黄疸、衰弱和渐进性消瘦为特征的一类血液细菌疾病，即羊无浆体病，急性发病时也可造成动物死亡。该病在世界各地广泛流行，在我国许多地区也时有发生，尤其是在某些牧区，严重阻碍了畜牧业的发展。因此，建立快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。

目前常用的诊断方法为血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。还有很多血清学方法，但都存在一定的假阳性或假阴性以及交叉反应。分子生物学诊断方法有套式PCR检测方法，参见：李树清，王贵强，陈志飞等，利用套式PCR检测牛羊乏质体，畜牧兽医学报，2011.42(12)：1768-1775，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染。

发明内容

本发明提供一种检测绵羊无浆体的试剂盒，应用这种检测试剂盒进行检测可克服现有技术不足。

本发明的检测绵羊无浆体的试剂盒内至少有如下的三条引物探针序列：正向引物SEQ№1，反向引物SEQ№2和探针SEQ№3，其中的探针序列的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有荧光猝灭基团BHQ1。

为方便使用，在本发明的检测绵羊无浆体的试剂盒中还包括有如下成分：荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA、阴性质控标准品。其中的荧光定量PCR反应液可以是由Premix Ex Taq^TM(2×)12.5μL，10μM的正向引物SEQ№1和10μM的反向引物SEQ№2各0.5μL，荧光探针溶液(5μM)1.0μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5μL，灭菌蒸馏水8.0μL组成。另外，本发明检测绵羊无浆体的试剂盒中的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA为由正向引物SEQ№4和反向引物SEQ№5扩增的DNA片段构建的pGEM-Teasy重组质粒；而阴性质控标准品可以是灭菌蒸馏水。

本发明实际上是一种利用gltA基因检测绵羊无浆体的实时荧光定量PCR方法。实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerasechain reaction，real-time FQ-PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR技术相比它所具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内外均未有检测绵羊无浆体实时荧光定量PCR方法的报道，本发明利用绵羊无浆体gltA基因作为实时荧光定量PCR检测靶基因，设计针对绵羊无浆体gltA基因的特异性引物和探针，从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测绵羊无浆体的方法，填补了技术空白。本发明中，通过对实时荧光定量PCR反应条条件的优化，使本发明具有良好的敏感性、特异性、重复性，其敏感性比常规PCR高100倍，可以用于绵羊无浆体的快速定量检测。

附图说明

图1实时荧光定量PCR扩增动力学曲线。

图2实时荧光定量PCR标准曲线。

图3实时荧光定量PCR灵敏度试验。

图4普通PCR检测方法电泳图。

其中M为DNA分子量标准DL2000；1、2、3、4、5、6、7、8分别为1.0×10⁷-1.0×10⁰拷贝/μL的质粒标准品；9为阳性对照；10为正常羊全血基因组；11为空白对照。

图5实时荧光定量PCR特异性试验。

图6实时荧光定量PCR批内重复性试验。

图7实时荧光定量PCR批间重复性试验。

具体实施方式

本发明以下结合附图和实施例作详细说明。