[发明专利]焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。 

背景技术

通过基因检测实现免疫抑制剂个体化基因导向治疗，是实现器官移植术后免疫抑制治疗成功的关键因素之一。 

他克莫司（Tacrolimus, FK605）为一种新型强效免疫抑制剂，对T细胞具有选择性抑制作用，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。其主要由CYP3A4，CYP3A5等代谢酶代谢，其中CYP3A5呈明显的多态性，其活性会显著影响他克莫司血浆及组织药物浓度，从而影响其疗效和不良反应发生率。CYP3A5*3突变等位基因导致CYP3A5酶活性缺失或下降，中国人群发生率约78%，其中突变型纯合子CYP3A5*3/*3约占全部人群的50%。研究表明，野生型(*1/*1)或杂合型(*1/*3)CYP3A5可迅速代谢他克莫司，造成血药浓度下降，因而他克莫司所需的剂量在CYP3A5*1/*1和*1/*3人群中均显著高于CYP3A5*3/*3人群。研究也发现突变型纯合子CYP3A5*3/*3患者出现肾毒性等不良反应的风险是野生型(*1/*1)或杂合型(*1/*3)CYP3A5杂合子患者的2.7倍。 

多药耐药基因MDR1(ABCB1)编码的转运体P-gp糖蛋白是药物跨膜转运泵，可以将药物由细胞内向细胞外泵出。因此当MDR1发生基因突变时，影响P-gp的表达和活性，进而可能改变细胞内和体内的血药浓度，影响药物的疗效和不良反应发生率。研究发现MDR1基因3435位C到T的突变，导致转运体活性下降，他克莫司及其代谢物从肾脏中排除减慢，发生肾毒性等不良反应的风险增加。而MDR1基因3435位的突变对他克莫司血药浓度的影响并不明显。 

综上所述，CYP3A5*3和MDR1基因多态性是影响他克莫司需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP3A5*3和MDR1基因多态性的试剂盒将为他克莫司的临床个体化治疗起到积极的推动作用。 

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。 

发明内容

CYP3A5*3 (rs776746)和MDR1 C3435T (rs1045642)基因多态性是影响他克莫司剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床他克莫司个体化用药治疗的用药基因CYP2D6（SEQ ID NO.1）和SULT1A1（SEQ ID NO.2）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测他克莫司个体化用药相关基因SNP。 

    为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 

一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

    CYP3A5*3 (rs776746)上游引物：5′-ACG TAT GTA CCA CCC AGC TT -3′（SEQ ID NO.3）；

    MDR1 C3435T (rs1045642) 上游引物：5′- GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA -3′（SEQ ID NO.4）；

    CYP3A5*3 (rs776746)下游引物：5′-GCC AGA CTT TGA TCA TTA TGT TA-3′（SEQ ID NO.5）；

    MDR1 C3435T (rs1045642)下游引物：5′- CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT -3′（SEQ ID NO.6）；

    其中，下游引物的5′进行生物素标记；

（2）测序引物：

CYP3A5*3 (rs776746)测序引物：5′- AGA GCT CTT TTG TCT TTC A -3′（SEQ ID NO.7）；

    MDR1 C3435T (rs1045642) 测序引物：5′- GGT GTC ACA GGA AGA GAT -3′（SEQ ID NO.8）；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测他克莫司用药基因多态性的方法，包括如下步骤： 

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：