[发明专利]猪ROSA26特异性整合位点及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪ROSA26特异性整合位点，属于遗传工程领域。

背景技术

近十年来，转基因技术得到迅猛的发展和广泛的应用，其与克隆技术的结合使转基因动物的生产从基础研究向产业化迈进成为可能，而转基因动物产业化成功的关键就在于使外源基因在转基因动物中稳定、高效和广泛的表达，目前研究表明，这主要与外源基因在宿主基因组中的整合位点相关，因此，获得到能使外源基因高效整合和稳定表达的整合位点是十分重要的。

在小鼠中，现已证明，ROSA26位点无论是在各个胚胎发育时期还是在成体各种组织器官中，即几乎所有的细胞中都能广泛且高效的介导外源基因表达，而且目前已有多个ROSA26转基因小鼠品系(Zambrowicz BP，ImamotoA，Fiering S，et al.(1997)Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expression of beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells.Proc Natl Acad Sci USA，94(8)：3789-3794；Kisseberth WC，Brettingen NT，Lohse JK，et al.(1999)Ubiquitous expression of marker transgenes in mice and rats.Dev Biol，214(1)：128-138)。此外，最近人ROSA26也已成功克隆，并也验证了其能介导外源基因在各种细胞类型中表达的广泛性(Stefan Irion，Herve Luche，Paul Gadue，et al.(2007)Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells.Nat Biotechnol，25：1477-1482)。虽然ROSA26位点在转基因小鼠中得到广泛应用，但在转基因大家畜中还未见报道。

目前，转基因大家畜的生产主要采用随机整合的方法，即外源基因随机整合在宿主基因组的一个或多个不确定的位点中，这种方法容易导致宿主重要功能基因失活，并且外源基因容易受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，导致表达沉默，不利于外源基因在转基因猪中稳定、高效和广泛的表达。另外，拷贝数和整合位点的不确定也不利于转基因动物的鉴定，困扰着转基因技术向产业化迈进。有研究表明，同源重组技术介导的基因定点打靶将会克服上述问题。当前，除了小鼠以外，很少见基因打靶获得的转基因大家畜，在转基因猪中更未见相关报道，这主要是由于缺少理想的外源基因整合位点。所以本发明对猪ROSA26位点进行鉴定与应用，这对转基因猪的生产和研究具有实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供猪ROSA26特异性介导位点，用以解决转基因猪外源基因表达的不稳定性以及位置效应的不可预知性。

本发明提供的猪ROSA26特异性整合位点，其DNA序列如以下1)或2)或3)所示：

1)其DNA序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种ROSA26特异性位点打靶载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种将猪ROSA26特异性介导位点在猪转基因中的应用。

所述启动子的应用，其特征在于用于猪外源基因或内源基因的稳定表达。

本发明采用的ROSA26特异性位点在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，能介导外源基因稳定高效的表达。提供的ROSA26特异性位点打靶载体可以高效特异的实现打靶。

附图说明

图15’同源臂的克隆与鉴定

A：PCR获得的5’同源臂(1.4kb)；B：DNAman的同源比对结果。

图23’同源臂的克隆与鉴定

PCR获得的3‘同源臂(3.6kb)。

图3载体构建和基因打靶